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| 編輯推薦： |
1抗菌脂肽（surfactin、fengycin等）合成调控研究成果
2基于基因组改组、蛋白质组学等技术的研究实践
3通过理化诱变及原生质体融合实现高产菌株选育的系统路径
4结合荧光定量PCR与双向电泳实现对关键基因与蛋白的分析
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| 內容簡介： |
本书主要介绍以淀粉液化芽孢杆菌为出发菌进行的抗菌脂肽合成调控相关研究。具体内容包括：芽孢杆菌抗菌脂肽研究相关基础内容、理化诱变选育出发菌株、基因组改组选育高产菌株、荧光定量PCR检测分析合成酶基因的表达量、高产突变菌株差异蛋白质组学研究等内容。
本书集结了作者多年科学研究工作的主要成果，有助于国内相关研究人员了解芽孢杆菌抗菌脂肽合成调控研究的进展与方法，从而推动抗菌脂肽在食品、医学等领域的广泛开发与应用。本书可为微生物、生物工程等领域研究人员提供参考，尤其适合从事抗菌脂肽相关研究的科研人员阅读。
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| 目錄：
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第1章绪论001
1.1芽孢杆菌抗菌脂肽研究进展002
1.1.1脂肽的种类、结构与合成002
1.1.2抗菌肽合成的代谢调节007
1.1.3脂肽的功能及应用011
1.2基因组改组研究进展013
1.2.1基因组改组的原理013
1.2.2基因组改组的技术路线014
1.2.3基因组改组的应用016
1.2.4基因改组技术展望019
1.3蛋白质组学研究技术019
1.3.1蛋白质组学的分类020
1.3.2蛋白质组学的应用021
1.3.3蛋白质组学的研究策略022
1.3.4蛋白质组学技术面临的问题024
1.4本研究的主要工作024
1.4.1研究目的和意义024
1.4.2研究的主要内容025
第2章淀粉液化芽孢杆菌理化诱变选育surfactin高产菌株026
2.1材料027
2.1.1仪器设备027
2.1.2菌种028
2.1.3培养基与溶液028
2.2理化诱变与筛选方法029
2.2.1诱变方法029
2.2.2筛选方法031
2.2.3高效液相色谱（HPLC）测定脂肽含量032
2.2.4抗菌脂肽产量计算方法032
2.3选育结果与分析032
2.3.1紫外诱变032
2.3.2NTG诱变033
2.3.3离子束诱变035
2.4讨论036
2.5本章小结036
第3章基因组改组选育淀粉液化芽孢杆菌surfactin高产菌株038
3.1材料039
3.1.1仪器设备039
3.1.2菌种040
3.1.3培养基与溶液040
3.2基因组改组实验方法040
3.2.1菌种保存040
3.2.2菌种初级诱变041
3.2.3原生质体的制备、灭活、再生与融合041
3.2.4基因组改组042
3.2.5surfactin产量测定043
3.3结果与分析043
3.3.1初始菌株的筛选043
3.3.2原生质体的制备条件研究043
3.3.3原生质体灭活条件研究047
3.3.4融合条件研究048
3.3.5融合子的挑选050
3.3.6基因组改组050
3.3.7菌株摇瓶发酵比较051
3.3.8FMB38的遗传稳定性052
3.3.9原始菌株（ES-2-4）与改组菌株（FMB38）在发酵罐中发酵性能比较053
3.4讨论054
3.5本章小结056
第4章实时荧光定量PCR检测突变菌株FMB38脂肽合成酶基因表达057
4.1材料058
4.1.1试剂058
4.1.2菌种058
4.1.3仪器设备059
4.2突变检测方法059
4.2.1引物设计059
4.2.2RNA提取前的实验准备059
4.2.3RNA提取060
4.2.4RNA质量检测鉴定060
4.2.5反转录PCR061
4.2.6荧光定量PCR061
4.2.7样本表达量的标准化062
4.3结果与分析062
4.3.1RNA提取062
4.3.2目的基因与内参基因qRTPCR扩增063
4.3.3样本中靶基因的相对定量063
4.4讨论065
4.5本章小结066
第5章抗菌脂肽高产突变菌株FMB38差异蛋白质组学研究067
5.1材料068
5.1.1试剂及溶液068
5.1.2菌种069
5.1.3仪器设备070
5.2差异蛋白质组学研究070
5.2.1样品收集070
5.2.2全蛋白提取和定量070
5.2.3双向电泳071
5.2.4凝胶染色072
5.2.5图像采集及图谱分析073
5.2.6胶内酶解、质谱鉴定074
5.2.7数据库查询075
5.2.8生物信息学分析075
5.3结果与分析075
5.3.1双向电泳体系的建立075
5.3.2差异表达蛋白质的鉴定080
5.3.3蛋白质等电点和分子量分析085
5.3.4蛋白质的细胞定位分析086
5.3.5实验鉴定差异蛋白质分类与功能分析086
5.3.6几个差异蛋白点的肽质量指纹图谱分析091
5.4讨论098
5.4.1质谱分析098
5.4.2蛋白质翻译后修饰099
5.4.3与surfactin合成有关的蛋白099
5.4.4与代谢有关的蛋白质100
5.4.5能量产生与转化相关蛋白102
5.4.6DNA复制、重组和修复相关蛋白102
5.4.7翻译及翻译后修饰相关蛋白103
5.4.8与信号传导机制等有关的蛋白104
5.4.9假想蛋白与未知蛋白104
5.5本章小结105
第6章抗菌脂肽fengycin生物合成调控机理研究106
6.1材料107
6.1.1菌种107
6.1.2培养基与试剂107
6.1.3仪器设备108
6.2fengycin生物合成调控研究109
6.2.1筛选方法109
6.2.2高效液相色谱检测脂肽含量110
6.2.3抗菌脂肽产量计算方法110
6.2.4原始菌株的初级诱变111
6.2.5基因组改组112
6.2.6遗传稳定性试验112
6.2.7荧光定量PCR检测fengycin合成酶基因113
6.2.8蛋白质组学113
6.3结果与分析113
6.3.1初始菌株的筛选113
6.3.2基因组改组115
6.3.3FMB72遗传稳定性116
6.3.4fengycin产生菌生物学特性及发酵条件研究117
6.3.5靶基因fenA的相对定量118
6.3.6差异蛋白质组学相关研究119
6.3.7fengycin合成调控因子相关研究125
6.4讨论125
6.5本章小结127
第7章总结与展望129
7.1surfactin研究130
7.2fengycin研究130
7.3未来研究展望131
参考文献133
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| 內容試閱：
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在食品工业中，有关食品的防腐保鲜始终是一个备受关注的话题。据美国食品药品监督管理局（FDA）统计，全世界每年约有10%~20%的食品损失于各种腐败。而在导致腐败的各种因素中，微生物的影响最为严重。人们为了在保证食品安全性的同时延长其保质期，常采取不同处理手段控制食品中的微生物。其中，化学防腐剂成本较低、化学性能稳定、抑菌谱较广、防腐效果好，经常用于食品防腐等。但随着人民生活水平的提高和食品安全意识的增强，人们对食品的安全卫生和自身健康有了更高层次的需求，天然、绿色的食品防腐剂更容易被消费者认可和接受。因此，开发高效、安全、无毒的天然食品防腐剂已成为国内外食品添加剂研究的主要方向。
微生物源的天然防腐剂具有安全性高、防腐效果好、制备简单等优点，因而具有独特的优势和广阔的市场前景。芽孢杆菌能够产生多种具有广谱抑菌活性的抗菌物质，具有巨大的研究和开发潜力。芽孢杆菌抗菌物质通常分为两大类：一类是核糖体合成的抗生素，主要为羊毛硫类抗生素（lantibiotics），包括subtilin、subtilosin、ericin等；另一类为非核糖体合成的脂肽类抗生素（lipopeptides），主要包括表面活性素（surfactin）、芬荠素（fengycin）、伊枯草菌素家族（iturin、bacillomycin、mycosubtilin）、杆菌溶素（bacilysin）等。抗菌脂肽是极具发展前景的新型食品防腐剂：①对食品中的多种革兰阳性及阴性细菌均有较强的杀灭作用，能快速抑制微生物的生长；②食用后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用；③在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性。
然而，一般的芽孢杆菌菌株抗菌脂肽产量很低。迄今为止，抗菌脂肽产生菌的产量一般低于10g/L，严重限制了抗菌脂肽的大规模应用。目前，已经有许多学者尝试采用不同的方法来增加抗菌脂肽的产量，但几乎所有的研究都集中在菌株传统诱变、发酵优化及分离提纯等方面，产量提高有限。因此，寻求更加有效的方法来提高抗菌脂肽产量显得尤为重要。基于目前抗菌肽的生产和需求现状，我们利用前期实验筛选到的产抗菌脂肽的菌株——淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ES2作为出发菌株，通过基因组改组的方法提高抗菌脂肽产量；结合差异蛋白质组学的方法，从翻译水平对比出发菌株和抗菌脂肽高产突变菌株的蛋白表达差异，筛选出与抗菌脂肽合成相关的关键信号蛋白；并进一步通过构建信号蛋白基因敲除及过表达载体、荧光定量PCR及凝胶阻滞等方法，分析抗菌脂肽产量提高的分子调控机理。研究结果不仅为抗菌脂肽产量的提高提供技术手段，还可丰富抗菌脂肽的生产调控机制，为从分子水平上改造淀粉液化芽孢杆菌，提高抗菌脂肽产量提供理论依据。这将有助于人类突破脂肽产量低、生产成本高、难以大规模应用等因素的限制，为开发新型、绿色、安全的食品添加剂、防腐剂及抗菌肽的实际应用奠定基础。
全书共7章。第1章是绪论部分，主要介绍芽孢杆菌抗菌脂肽的研究现状、基因组改组技术及蛋白质组学的研究方法和进展；第2章介绍了如何利用传统理化诱变获得高产菌株；第3章介绍了如何利用基因组改组技术提高surfactin产量；第4章介绍了如何利用荧光定量PCR检测surfactin合成酶基因的表达量；第5章介绍了如何采用蛋白质组学技术分析出发菌株与高产突变株之间的蛋白表达差异，并获得差异表达蛋白的相关信息；第6章介绍了抗菌脂肽fengycin的合成调控研究；第7章对笔者的抗菌脂肽相关研究工作进行了总结，并对下一步的工作进行了展望。
对于本书的出版，笔者所在的河南科技大学给予了很大的支持，得到了河南科技大学博士科研启动经费的大力资助。在本书编写期间，得到了不少同事和朋友的关心和帮助，在此感谢邱智军老师、纠敏老师、原江锋老师在图表绘制、文字校对和排版方面所给予的支持和帮助。
由于作者水平有限，本书难免有疏漏之处，敬请广大读者批评指正。
作者
2022年3月于洛阳
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