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| 內容簡介： |
《基因工程实验指南》主要介绍植物分子生物学实验中基本技术的原理和操作流程，按照实验进程的顺序，由浅入深，由简至繁，向初学者逐步介绍各种实验操作技术。主要包括植物DNA和RNA的提取和检测、反转录RNA、RT-PCR技术、DNA的扩增、DNA片段的琼脂糖凝胶电泳和回收纯化、聚丙烯酰胺变性凝胶电泳、DNA限制性内切酶酶切分析、大肠杆菌和农杆菌感受态细胞的制备、PCR产物连接、连接产物的转化、农杆菌转化法、挑菌、摇菌、保菌、菌液PCR检测、质粒提取和检测、ABI3730XL测序实验程序、基于毛细管电泳的荧光检测SSR实验程序、半定量 PCR技术、实时荧光定量PCR技术、Southern blotting、Northern bloting、原核表达、Western bolting技术、目标蛋白的亚细胞定位、蛋白互作检测、真空渗透法转化拟南芥、烟草瞬时表达、农杆菌侵染法转化烟草、抗生素溶液的配置等基本的实验技术。《植物基因工程实验指南》是一本既具有一定的理论体系，又具有通用性和指导性作用的实验教学用书。
《基因工程实验指南》主要介绍植物分子生物学实验中基本技术的原理和操作流程，按照实验进程的顺序，由浅入深，由简至繁，向初学者逐步介绍各种实验操作技术。主要包括植物DNA和RNA的提取和检测、反转录RNA、RT-PCR技术、DNA的扩增、DNA片段的琼脂糖凝胶电泳和回收纯化、聚丙烯酰胺变性凝胶电泳、DNA限制性内切酶酶切分析、大肠杆菌和农杆菌感受态细胞的制备、PCR产物连接、连接产物的转化、农杆菌转化法、挑菌、摇菌、保菌、菌液PCR检测、质粒提取和检测、ABI3730XL测序实验程序、基于毛细管电泳的荧光检测SSR实验程序、半定量 PCR技术、实时荧光定量PCR技术、Southern blotting、Northern bloting、原核表达、Western bolting技术、目标蛋白的亚细胞定位、蛋白互作检测、真空渗透法转化拟南芥、烟草瞬时表达、农杆菌侵染法转化烟草、抗生素溶液的配置等基本的实验技术。《植物基因工程实验指南》是一本既具有一定的理论体系，又具有通用性和指导性作用的实验教学用书。
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| 關於作者： |
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作者来自农大生物科技学院和基因工程教学研究室的博士毕业研究生及讲师。她们多年从事本科生和硕士研究生的专业基础课教学、实验以及横向科研的指导。该书主要面向高等本科院校生命科学、作物学及分子生物学初级研究者。
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| 目錄：
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第一章 仪器设备 001
分子生物学实验室常用仪器设备简介 001
第二章 核 酸 009
第一节核酸的构成 009
第二节基因组 DNA 的提取 014
第三节TENS 法提取微生物基因组 DNA 018
第四节DNA 的扩增 019
第五节 DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳和回收纯化 021
第六节DNA 重组及鉴定 028
第七节核酸分子杂交技术 031
第八节Southern blotting 技术 041
第九节植物总 RNA 的提取和检测 048
第十节poly（A）RNA 的提取 051
第十一节无菌感染期线虫 RNA 的提取 051
第十二节果蝇总 RNA 的提取 053
第十三节哺乳动物 RNA 的提取 054
第十四节反转录 RNA 055
第十五节半定量 PCR 技术 056
第十六节实时荧光定量 PCR 技术 057
第十七节Northern bloting 技术 059
第十八节核酸染色 061
第十九节双脱氧链终止法测序技术 064
第二十节焦磷酸测序（Pyrosequencing） 066
第二十一节核酸信息分析 068
基因工程 实验指南
第三章 蛋 白 质 080
第一节定量蛋白质组学 084
第二节植物蛋白的提取 085
第三节动物蛋白质的提取 088
第四节动物细胞器蛋白的提取 089
第五节细菌蛋白质的提取 093
第六节原核表达 094
第七节用 IPTG 诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白 098
第八节蛋白质的定量 099
第九节聚丙烯酰胺变性凝胶电泳 104
第十节非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 108
第十一节双向凝胶电泳 110
第十二节Western bolting 技术 114
第十三节蛋白质转印实验半干式 116
第十四节蛋白质转印实验 电泳液式 118
第十五节蛋白质染色 119
第十六节染色质免疫沉淀技术（ChIP） 121
第十七节凝胶迁移实验（EMSA） 125
第十八节超迁移 EMSA（Super-Shift EMSA） 129
第十九节蛋白质序列分析 131
第四章 载体构建及扩繁 132
第一节DNA 限制性内切酶酶切分析 132
第二节PCR 产物连接 135
第三节连接产物的转化 136
第四节挑菌与摇菌 140
第五节保菌 141
第六节菌液 PCR 检测 141
第七节质粒提取 142
第八节质粒 DNA 的电泳检测 145
第九节ABI3730XL 测序实验程序 146
目 录
第十节感受态细胞的制备 151
第十一节农杆菌转化法 152
第十二节基于毛细管电泳的荧光检测 SSR 实验程序 153
第五章 蛋白质蛋白质相互作用 156
第一节目标蛋白的亚细胞定位 156
第二节酵母双杂交 160
第三节酵母文库的筛选 164
第四节免疫共沉淀 165
第五节GST 融合蛋白进行 Pulldow 实验 168
第六节双分子荧光互补（BiFC） 169
第七节荧光共振能量转移
［Fluorescence resonance energy transfer（FRET）］ 175 第八节 Far Western blotting 印迹法176
第九节酵母单杂交实验 179
第十节原生质体提取及转化步骤 180
第六章 作物转化 183
第一节浸蘸法转化拟南芥 185
第二节农杆菌侵染法转化烟草 187
第三节烟草瞬时表达 190
第四节农杆菌侵染法水稻 191
第五节生理指标的测定 193
第七章 常用试剂的配制 197
第一节抗生素溶液的配制 197
第二节常用缓冲液的配制 198
第三节常用培养基的配制 207
参考文献 211
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| 內容試閱：
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第一章仪器设备
分子生物学实验室常用仪器设备简介
一、实验原理
1.恒温气浴摇床
用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养、发酵、杂交、生化反应及酶和组织研究等。
2.超净工作台用于分子生物学无菌操作。3.低温台式高速离心机
用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。
4.微量移液管
该仪器是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。有多种规格：①0.5~10ml；②10~100ml；③20~200ml；④100~1000ml。
5.电泳仪用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。6.PCR仪
用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。
7.灭菌锅用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。8.冷冻离心机
低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其他生物样品的分离制备实验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。
9.数字式酸度计
数字式酸度计设计精良，使用非常方便。能自动地补偿测量中由于温度变化产生的误差。
基因工程实验指南
仪器测得的pH值、MV或温度值，可由仪器的液晶显示屏上读出，显示屏并具有背光功能。仪器还能内置式充电，使用人员可携带到户外经行操作测量。底电压提醒用户及时充电。
10.分光光度计
不同物质对不同波长入射光的吸收程度各不相同，从而形成特征性的吸收光谱。分光光度法不仅适应于可见光区，同时还可扩展至紫外光区及红外光区，因此给科研实验带来了极大方便。下面重点介绍分光光度计的使用及注意事项。
11.分析天平
分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动、全自动加码电光投影阻尼分析天平及电子分析天平等。
二、实验仪器
恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、数字式酸度计、分光光度计和分析天平。
三、操作步骤
1.恒温气浴摇床的使用
（1）样品瓶牢固放入弹簧夹中。
（2）接通电源开关，仪器进入准备状态。
（3）参数设定（设定温度、时间、转速等参数）。
（4）按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转。
（5）按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关。
2.超净工作台的使用
（1）使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。
（2）接通电源，提前30min打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，15min后，关闭紫外灯，开启送风机。
（3）工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
（4）操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
（5）最后开启工作台紫外灯，照射消毒30min后，关闭紫外灯，切断电源。
3.低温台式高速离心机的使用
（1）把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。
（2）打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡，完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。
002
第一章仪器设备
（3）关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。
（4）插上电源插座，按下电源开关（电源开关在离心机背面，电源座上方）。
（5）设置转子号、转速、时间，即在停止状态下时，用户可以设置转子号、转速、时间，此时离心机处于设置状态，停止灯亮、运行灯闪烁；按下启动离心开始（常用，最高转速为13000rpmmin，时间最长为20min）。
注意：对应的转子一定要设置在相应的转速范围内，不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。
（6）离心机时间倒计时到0时，离心机将自动停止，当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。
4.微量移液管的使用
（1）将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）。
（2）将微量移液器按钮轻轻压至第一停点。
（3）垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部。
（4）缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少。
（5）等1min后将吸嘴提离液面。
（6）平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体。
（7）提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
5.PCR的使用
（1）开机。打开开关，视窗上显示SELFTEST。
（2）放入样品管，关紧盖子。
（3）如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按
《Proceed》，则开始执行程序。
（4）如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTERPROGRAM，按《Proceed》，①命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认（如何输入字母、数字）。②输入程序步骤：名字输入后，确认，然后输入相关程序。
（5）输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。
（6）其他。用《Pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《Stop》或
《Cancel》可停止运行的程序。
6.电泳仪的使用
电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶―G薄层等，分子生物学实验中最常用的是琼脂糖凝胶
基因工程实验指南
电泳。应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分提取制备。
（1）首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。
（2）按电源开关，显示屏出现欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。
（3）确认各参数无误后，按启动键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start，并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示Run，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）。
（4）电泳结束，仪器显示：END，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。
7.高压灭菌锅
（1）开盖。转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没至板上。
（2）通电。将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮。
（3）堆放物品。需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm100mm100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果，灭菌时间：121℃，20min，如为液体，液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中，且不可装满，23即可，121℃，18~20min。
（4）密封高压锅。推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧。
（5）设定时间和温度，开始灭菌。
（6）灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气。
8.冷冻离心机
离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0~30℃，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。
（1）离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。
（2）打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。
（3）按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。
（4）按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。
（5）待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔
第一章仪器设备
内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。
（6）注意事项。
①机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。
②开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入。
③样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。
④挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。
⑤擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。
⑥每次操作完毕应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。
⑦离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。附：相对离心力与每分钟转速的换算。离心机的转速，在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示。由于离心力不仅为转速函
数，亦为离心半径的函数，即转速相同时，离心半径越长，产生的离心力越大。因此仅以转速表达离心力是不够科学的，近年来主张用相对离心力（RCF）来表示比较合理。现在国际资料中，已改用相对离心力来表示。
9.数字式酸度计
（1）准备工作。
①仪器应平放在符合使用环境的工作台上，依视觉角度支起支架。
②pH值的定位测量法。
（2）二点定位法（高精度测量方法）。
①连接好电极线路，将参比电极及活化满24h以上清洁的pH电极移入第一标准缓冲液pH1值中（例pH1值=4.00），待仪器响应稳定后，调节定位旋钮至仪器显示为0.00。
②将电级系统从第1种标准液中取出，用去离子水冲洗干净后以滤纸吸干电级表面水分，移入第2种标准液（例pH2值=9.18）中，仪器响应稳定后，调节斜率旋钮，使仪器显示为
（△pH值=pH1值-pH2值=9.18-4.00=5.18）此后斜率旋钮不可再动，除非更换电极系统。
③斜率调节完成后，重新调节定位旋钮，使仪器显示第2种标准液的实际pH值（9.18），至此2点定位结束。
④将电极从第2种标准液中取出冲洗、吸干后移入待测溶液中，仪器响应稳定后显示的数值即为待测溶液的pH值。
（3）一点定位法（粗略测量法）。
①将温度补偿旋钮调至溶液温度值。
②向左将斜率补偿旋钮旋转至头。
③将电级系统移入标准液中（一点法仅用一种标准液，如pH值=4.00时），调节定位旋钮使仪器显示4.00。
④取出电级冲洗吸干水分后移至待测溶液中，仪器响应稳定后显示的数值即为待测溶液
基因工程实验指南
的pH值。
（4）温度的测量。
①将功能选择拨至温度档。
②将温度探头插入插孔，并将温度探头置于环境条件或溶液中，仪器响应稳定后仪器显示值即为环境条件或溶液温度值。
（5）注意事项。
①认真做好仪器使用前准备工作。
②仪器通电后或测量过程中出现显示不稳或乱跳现象，应切断电源进行检查，如电压、预热时间及电极系统等是否正常。
③使用不同电极应注意排除离子的干扰，选择好盐桥，必要时应使用离子强度固定剂。
④电极系统从第1种溶液取出移入第2种溶液之前，须用去离子水或双蒸水清洗干净，再用滤纸吸干表面水分，以免影响测定结果的准确性。
⑤仪器应存放于干燥、清洁无腐蚀的场所，每次测量结束后应关闭电源，退出电极及温度探头妥善保存。玻璃电极清洗后可浸于去离子水待用（注意水面不得低于玻璃球泡），甘汞电极清洁后套上橡皮帽置于配套盒中保存，当甘汞电极内充液泄漏或不饱和及盐桥中断时，应及时补充饱和内充液。
⑥该类仪器均采用大规模集成电路，输入阻值较高，在对仪器内部进行任何零部件修理焊接时，应使用45W以下有良好地线的烙铁，无接地线烙铁应拨下电源插头焊接。
（6）pH值（酸碱度）测量。
①将功能选择拨至pH档，调节定位旋扭，斜率补偿旋钮及温度补偿旋钮显示值应有相应变化。
②通过仪器温度档测定标准液及待测样品液温度（要求两种液体温度保持一致，以减少测定误差），并用温度补偿旋钮调节至溶液实际温度值。
10.分光光度计
（1）接通稳压器电源，待稳压器输出电压稳定至200V后打开光度计电源，仪器自动进入初始化。
（2）初始化约需时10min，内容包括：
①寻找零级光。
②建立基线。
③最后当显示器指示nm时，表明仪器完成初始化程序，可进入检测状态。
（3）按要求输入各项参数，选择相应比色杯（玻璃或石英），将空白管、标准管及待测管依次放入比色皿架内，关上比色池盖。
（4）以空白管自动调零。
（5）试样槽依次移至样品位置，待数据显示稳定后按STARTSTOP键，打印机自动打印所测数据，重复上述步骤，直到所有样品检测完毕。
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