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| 內容簡介： |
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《生物化学与分子生物学实验技术》一书对实验安全知识和生物大分子的制备作了全面扼要的介绍，并着重介绍了常用生物化学和生物大分子学实现技术,共十七章。内容包括光谱分析技术、色谱技术、膜分离技术、离心技术、电泳技术、核酸操作技术、基因文库技术、聚合酶链式反应扩增技术、重组DNA技术、外源基因表达技术、基因沉默技术、DNA序列测定技术、分子杂交技术和生物芯片技术的基本原理和实验方法，同时对生物信息学技术进行了简明扼要的介绍。《生物化学与分子生物学实验技术》可作为高等院校生物工程、生物技术、食品科学与工程、生物制药、动物医学、动物科学、发酵工程、卫生检验和医学等专业的教材，也可供相关专业的学生、教师和科研工作者参考。
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| 關於作者： |
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蔡勇，西北民族大学生命科学与工程学院，实验室主任、副教授、硕导，主要教学经历2005.7—— 担任动物医学本科专业、动物科学本科专业的《动物生物化学》课程2007.1—— 担任生物工程本科专业、生物技术本科专业的《生物化学》课程2009.1—— 担任基础兽医、预防兽医、临床兽医、动物遗传育种与繁殖、动物营养和特种经济动物养殖硕士研究生的《高级生物化学》课程科学研究、实践经历自2005年工作以来，一直从事生物化学与分子生物学的教学与科研工作，先后承担西北民族大学教改项目2项；主持或参与国家自然科学基金、甘肃省科技支撑计划、甘肃省农牧厅生物技术专项、兰州市科技计划项目和中央高校基本业务费科研项目等15项，获甘肃省高校科技进步一等奖1项，甘肃省科技进步三等奖1项。
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| 目錄：
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第一章生物化学及分子生物学实验基本操作技术第一节生物化学及分子生物学实验技术发展简史1一、生物科学发展简史1二、生物化学发展简史3三、我国生物化学的发展4第二节实验室规则及安全防护4一、实验室规则4二、有害化学物的处理5三、实验室安全及防护知识6第三节常用器皿的使用10一、常用玻璃量器的规格10二、常用器皿的清洗10三、玻璃仪器的干燥11四、清洗液的种类及配制11五、玻璃仪器的使用12六、常用玻璃量器的校正12第四节移液器的种类和使用13一、滴管13二、吸量管13三、微量进样器15四、自动移液器16第五节溶液的混匀17一、搅拌法17二、旋转法18三、弹打法18四、离心法18五、吹打法18六、涡旋法18七、振荡器混匀法19第二章生物大分子制备技术第一节生物材料的选择与采集20一、生物材料的选取20二、生物材料的采集与保存20三、生物材料的预处理21第二节组织及细胞的破碎23一、机械破碎法23二、物理破碎法24三、化学破碎法25四、酶学破碎法25第三节生物大分子的提取26一、活性物质的保护措施26二、影响提取的因素27第四节生物大分子的分离、纯化和定量29一、分离纯化原理29二、分离纯化方法的选择与分离程序30三、目标物质初分离30四、目标物质的纯化与纯度鉴定31第五节浓缩、干燥及保存33一、制品的浓缩33二、制品的干燥33三、制品的保存34第三章光谱分析技术第一节紫外-可见吸收光谱分析35一、光谱产生的过程35二、光谱的分类36三、常用吸收光谱分析术语37四、朗伯-比尔定律39五、紫外-可见分光光度计的基本构造39六、紫外-可见分光光度计的分类41七、紫外-可见吸收光谱分析方法41八、紫外-可见吸收光谱分析的影响因素44九、可见光比色分析条件的选择46第二节荧光光谱分析技术47一、荧光分析的基本原理47二、相关概念和参数47三、荧光仪器的基本结构及光电系统48四、荧光分析的应用49第三节原子吸收光谱分析技术51一、原子吸收分光光度计的原理51二、原子吸收光谱的产生51三、基态原子数和激发态原子数的关系52四、待测元素的定量52五、原子吸收光谱分析的优点52第四章色谱技术第一节色谱技术分类53一、按固定相和流动相所处的状态分类53二、按色谱分离原理分类54三、按实验技术分类54四、根据操作方式分类55第二节层析的基本理论55一、分配系数56二、阻滞因数或Rf57三、洗脱体积Ve57四、色谱法的塔板理论57五、色谱图59六、分离度60七、色带的变形和“拖尾”61第三节柱色谱系统基本操作方法62一、装柱62二、平衡63三、上样量和上样体积63四、洗脱64五、流速及控制65六、分部收集66七、检测和合并收集66八、洗脱峰的纯度鉴定66九、脱盐和浓缩67第四节常用的色谱方法67一、吸附色谱法67二、分配色谱法73三、凝胶色谱法76四、离子交换色谱法79五、亲和色谱技术84六、薄层色谱法88七、气相色谱99八、高效液相色谱102第五章膜分离技术第一节过滤109一、过滤的分类110二、过滤装置110三、过滤的操作过程111第二节半透膜分离技术111一、膜分离技术概况111二、膜分离技术基本原理112三、膜的性质112四、分离方式112五、透析袋的处理、保存113第三节微滤114一、微滤的基本概念和分离范围114二、微滤的操作模式114第四节超滤技术115一、超滤装置与工作原理115二、影响超滤的几个因素117三、超滤技术的应用117第六章离心技术第一节离心技术基本原理118一、离心力和相对离心力118二、沉降速度120三、沉降系数120四、离心时间120第二节离心机的主要构造和分类120一、制备型离心机121二、分析型离心机123第三节离心的基本方法123一、沉淀离心124二、差速沉降离心法124三、密度梯度区带离心法124四、连续流离心126五、分析超离心126第四节离心操作注意事项127第七章电泳技术第一节电泳技术概况及基本原理128一、电泳技术发展简史128二、电荷的来源129三、泳动度129四、影响电泳的因素130五、电泳的分类131第二节纸电泳132第三节醋酸纤维素薄膜电泳132一、原理及特点132二、操作要点133三、应用133第四节琼脂糖凝胶电泳133一、琼脂糖凝胶的特点133二、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系134三、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系134四、琼脂糖凝胶电泳基本方法简介134第五节聚丙烯酰胺凝胶电泳135一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性135二、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳137三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳140四、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳141五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳143六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳148第六节染色方法151一、蛋白质染色151二、糖蛋白染色153三、脂蛋白染色154四、核酸染色154五、同工酶染色156第七节毛细管电泳157一、毛细管电泳的基本原理157二、毛细管电泳的类型158三、毛细管电泳装置159四、几种毛细管电泳分离模式的基本原理160五、毛细管等速电泳162第八节其他电泳技术163一、免疫电泳163二、单细胞电泳165三、脉冲凝胶电泳165四、印迹转移电泳166五、温度梯度凝胶电泳166六、逆向色谱电泳166七、介体电泳167第八章核酸操作基本技术第一节核酸的提取与纯化168一、基本原理168二、微生物DNA的提取169三、动物细胞DNA的提取172四、植物细胞核DNA的提取173五、核外DNA的提取175六、RNA的提取177第二节核酸的检测与保存180一、核酸的检测180二、核酸的保存182第三节核酸的凝胶电泳183一、琼脂糖凝胶电泳183二、聚丙烯酰胺凝胶电泳185第九章基因文库技术第一节基因组文库的构建186一、载体的选择187二、基因组DNA的制备187三、基因组DNA的处理187四、载体与外源DNA的连接188五、重组DNA的体外包装和转入宿主细胞188六、文库的检测、扩增和保存188第二节cDNA文库的构建189一、cDNA文库构建的基本原理与方法189二、cDNA全长文库189三、cDNA文库质量评价190四、cDNA文库的其他类型191第三节基因文库的扩增和保存192第四节克隆基因的分离与鉴定193一、通过重组体表型特征进行筛选鉴定193二、通过重组DNA分子结构特征进行筛选鉴定194三、通过外源基因的表达产物进行筛选鉴定194四、cDNA文库分离新基因的方法195第十章聚合酶链式反应扩增技术第一节聚合酶链式反应扩增原理197第二节PCR反应体系198一、引物198二、底物（dNTP）199三、模板199四、Taq DNA聚合酶199五、PCR缓冲液200六、镁离子200第三节PCR反应条件的选择200一、温度循环参数200二、PCR反应动力学201第四节PCR引物及其设计201一、PCR引物设计的基本原理201二、引物设计软件203第五节常用的PCR方法203一、原位PCR203二、逆转录PCR204三、实时定量PCR206四、甲基化PCR207五、巢式PCR208第六节PCR技术的应用209一、核酸的基础研究209二、序列分析210三、检测基因表达210四、从cDNA库中放大特定序列210五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段210六、进化分析210七、医学应用211八、分析生物学证据211九、性别控制211十、转基因检测211第十一章重组DNA技术第一节分子克隆常用的工具酶213一、限制性核酸内切酶214二、DNA聚合酶215三、DNA连接酶216四、核酸酶217五、碱性磷酸酶220第二节目的基因的获取221一、直接从染色体中分离221二、聚合酶链式反应（PCR）扩增基因221三、通过mRNA合成cDNA221四、人工体外合成DNA片段222第三节载体222一、组成载体的元件223二、载体的分类223三、几种常用的载体224第四节DNA分子的体外连接229一、全同源黏性末端的连接229二、平头末端连接229三、定向克隆229四、利用连接子连接229五、利用适配子连接230第五节宿主细胞230一、原核细胞Ecoli230二、真核细胞230三、模式植物——拟南芥231第六节外源基因导入宿主细胞231第七节重组子的鉴定和外源基因的表达232一、重组子的鉴定232二、外源基因的表达233第十二章外源基因表达技术第一节基因表达的调控元件234第二节外源基因在宿主细胞中的高效表达235一、有效的转录起始与基因的高效表达235二、mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达237三、mRNA的稳定性与基因的高效表达237四、有效的翻译起始与基因的高效表达237五、遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达239六、mRNA的二级结构与基因的高效表达243七、RNA的加工与基因的高效表达243八、mRNA序列上终止密码子的选择243九、表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性与基因的高效表达243十、外源蛋白质的稳定性与基因的高效表达244第三节基因的融合和融合蛋白的表达244一、利用基因融合技术表达外源基因的优势244二、基因融合的策略245三、基因融合和重组蛋白的产生246四、基因融合和展示筛选247五、基因融合和蛋白分泌248六、融合蛋白的纯化248七、融合蛋白的位点特异性切割249第四节外源基因的分泌表达249一、外源基因在Ecoli细胞中的分泌表达250二、外源基因在枯草杆菌中的分泌表达251三、α-因子前导序列介导的酵母细胞分泌系统252四、外源基因在哺乳动物细胞中的分泌表达255第十三章基因沉默技术第一节基因沉默的机制258一、转录水平上的基因沉默258二、转录后的基因沉默259第二节RNA干扰260一、概述260二、RNAi的可能作用机制260三、RNAi的作用特点261四、RNAi的研究方法262第三节基因沉默的特点及其应用265一、基因沉默是获得性免疫的新途径265二、基因沉默的克服技术265三、基因沉默的应用266第十四章DNA序列测定技术第一节Sanger双脱氧链终止测序法270一、Sanger双脱氧链终止法的原理270二、Sanger双脱氧末端终止测序法技术272三、PCR-Sanger测序法274第二节Maxam-Gilbert DNA化学降解测序法274第三节新一代高通量测序技术275一、新一代测序技术简介275二、新一代测序技术带来的技术变化277三、高通量测序技术在动植物研究领域中的应用278四、新一代高通量RNA测序数据的处理与分析291第十五章分子杂交技术第一节分子杂交的发展及其分类301一、分子杂交技术的发展历程301二、分子杂交的种类301三、分子杂交的技术路线302第二节探针的制备302一、探针的种类302二、标记物的选择303三、探针的放射性同位素标记306四、探针的非放射性标记307五、膜上印迹杂交的条件选择307六、杂交信号的检测309第三节Southern印迹310第四节Northern印迹311第五节Western印迹312一、Western blot印迹方法313二、固定化膜的种类314三、电泳转移314四、封闭315五、探针杂交315六、显色316七、结果分析316八、抗血清的制备317第十六章生物芯片技术第一节生物芯片简介323一、生物芯片简介323二、生物芯片的种类323第二节基因芯片的基本原理和基本流程325一、基因芯片的基本原理325二、基因芯片的基本流程325第三节生物芯片的应用329一、基于芯片的序列分析329二、基于芯片的基因功能分析332三、基因诊断334四、药物筛选334第四节生物芯片的数据处理和分析334一、数据处理334二、数据分析335第十七章生物信息学技术第一节生物信息学概况341一、生物信息学的产生和发展341二、生物信息学的研究内容341第二节生物信息数据库342一、核酸数据库343二、蛋白质数据库345三、其他数据库资源348第三节序列比对和数据库搜索348一、序列两两比对348二、多序列比对351三、核酸与蛋白质结构和功能的预测分析351第四节生物信息学的应用356一、生物信息学在作物抗性研究中的应用356二、生物信息学与人类基因组计划358参考文献
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第十三章 基因沉默技术基因沉默（gene silencing）是指生物体特定基因由于某种原因丧失表达的现象。发生沉默的基因可以是外源转移基因，也可以是入侵病毒甚至是宿主的内源基因。研究表明，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等都与基因沉默有关。基因沉默一般有两种情况，一种是转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），即由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的基因沉默。另一种是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），即在转录后通过对目标RNA进行特异性降解而使基因沉默。转基因沉默就是外源导入并整合进受体基因组中的外源基因在当代转化体或其后代中的表达受到抑制而不表达的现象。转基因沉默是目前动物基因工程技术实现商业化的大障碍。基因工程技术的内涵不仅仅是基因的转移和获得特异性蛋白质的表达，抑制或消除生物体基因组内某些基因的表达也是遗传工程技术的另外一个内涵。消除或抑制基因表达的基因工程技术叫做基因沉默（gene silencing）技术。基因的沉默就是基因表达的抑制或消除。基因沉默技术就是通过构建反义基因（antisense gene）或有义基因（sense gene）来阻止蛋白质的合成。实现基因沉默有两种方法，一种是阻止mRNA的合成，另一种就是使mRNA在到达核糖体之前失效，这两种方法都可阻止蛋白质的合成，从而消除该基因的表达，实现基因沉默。有义基因具有与靶细胞基因相同的编码序列，它是由从靶细胞中获得的mRNA通过反转录酶催化反转录而产生的。将有义基因做一些小的改变，加载到侵染体上，然后进行转移就可以达到沉默基因的目的。目前，通过转移有义基因来实现基因沉默的技术尚不完善。其有效性取决于有义基因在靶细胞基因组中所嵌入的位置。有义基因抑制源生基因的机理目前尚不清楚。反义基因的核酸序列和靶细胞中内源基因的序列是互补的，反义基因可由DNA合成仪合成，加载到侵染体上后转移到靶细胞中去。被转移的反义基因开始转录mRNA，而此时所转录的mRNA是内源基因转录的mRNA的互补链，因此内源基因转录的mRNA就被混合或杂交了，杂交后的mRNA失去了正常的功能，不能指导合成原来的蛋白质，从而阻止了原性状的表达，实现了基因沉默。基因沉默技术在植物中首先应用在番茄上，其效能是通过基因沉默增加番茄硬度从而延长存放时间。实现这一目的的技术就是基因沉默技术。具体的原理是利用基因沉默技术消除或抑制控制番茄熟化反应的酶的基因，减少该酶的分泌，从而延长熟化过程，达到延长保存时间的目的。利用该技术已经成功培育出了存放时间较长的番茄品种。另外，利用基因沉默延缓熟化过程的技术已在其他水果和蔬菜品种的培育上广泛使用，并取得了积极的效果。基因沉默技术还可应用于医学领域，利用此技术可消除某些致病基因，还可关闭某些基因的表达，如致癌基因、艾滋病病毒基因、白血病基因以及其他有害基因，从而实现对遗传性疾病和传染病的控制以及基因治疗。节 基因沉默的机制外源基因进入细胞核后，会受到多种因素的作用，根据其作用机制和水平的不同可将基因沉默分为转录水平上的基因沉默和转录后的基因沉默。一、转录水平上的基因沉默转录水平上的基因沉默是DNA水平上基因调控的结果，主要是由启动子甲基化或导入基因异染色质化所造成的，二者都和转基因重复序列有密切关系。重复序列可导致自身甲基化。外源基因如果以多拷贝的形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复（direct repeat）或头对头、尾对尾的反向重复（inverted repeat）序列，则该基因就不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默（repeat-induced gene silencing，RIGS）与在真菌中发现的重复序列诱导的点突变（repeat-induced point mutation，RIPM）相类似，均可能是重复序列间自发配对，而甲基化酶特异性地识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。此外，重复序列间的相互配对还可以导致自身的异染色质化。（一）甲基化作用机理甲基化作用是在基因转录水平上进行调控的一种基本方式。宿主基因组中各个不同基因位点的甲基化程度处在一定的平衡状态，且具有一定的空间结构特点。一旦由于外源基因的整合或病毒的侵入打破了这种平衡和空间结构特征，这种受破坏后的结构就会成为宿主基因组所识别的信号，结果使新整合进去的DNA序列发生不同程度的甲基化，进而妨碍了该基因转录的顺利进行，从而实现基因的沉默。（二）位置效应机理侵入宿主的病毒基因或外源转移基因会在基因组DNA的不同位置随机整合。如果这些外源基因整合到宿主基因的异染色质区或进入转录不活跃区，则外源基因会在该区空间结构特征的影响下形成类似结构，从而导致基因的不活跃转录或异染色质化而失活。但如果整合位置是处于基因组转录活性区域，那么外源基因也会形成类似的结构，使转录呈现活跃状态，并且转录频率随其侧翼DNA序列转录频率的变化而发生相应的改变。（三）正反向同源基因和多拷贝重复基因引起的TGS机理在转录水平上，同源基因在同源性较高的情况下或在某些因子的影响下，可发生相互作用而使同源序列发生甲基化并失活。同样地，多拷贝重复基因序列在整合进基因组后不论是正向还是反向都容易形成异位配对，引起基因组防御系统的识别而被甲基化或异染色质化从而失活，其机理可能是异染色质化相关蛋白质识别重复序列间配对形成的拓扑结构并与之结合，从而将重复序列牵引到异染色质区，或直接使重复序列局部异染色质化。（四）复杂结构外源基因引起的TGS机理如果外源基因的组织结构比较复杂，则这种基因不容易形成规则的结构而且存在更多的酶切位点，因而在同宿主基因组DNA整合的过程中，容易引起基因的置换、重排，也容易被宿主的防御系统所识别而遭破坏。有研究表明，通过基因枪将只含有基因表达弹夹，包括启动子、可读框、终止子在内的线性DNA片段导入植物基因组，结果获得了外源基因拷贝数大、重排频率低、表达高效的转基因植株。但是使用结构比较复杂的完整质粒将外源基因导入基因组后，其整合方式复杂，产生的是高拷贝数、高重排频率的植株，转移基因的活性以及稳定性受到严重影响。
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