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《白桦抗旱耐盐和次生壁形成的分子机理》可供林学专业的高年级本科生、研究生学习参考，也可以作为林业院校和师范院校林木遗传育种、分子生物技术等相关专业研究生的科研参考书。
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| 內容簡介： |
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《白桦抗旱耐盐和次生壁形成的分子机理》首先进行BplMYB46转录因子的核定位；分析该基因是否被胁迫诱导以及在不同部位的表达。克隆启动子，进行顺式元件分析，检测其活性；构建过表达和抑制表达载体，转基因后进行胁迫处理，根据表型、组化、生理指标、解剖学以及SOD等基因的表达确定BplMYB46基因是否具有抗逆性和在调控次生壁形成中的功能；分析其是否有转录激活活性以及与同源的白桦MYB的互作；构建随机元件库，酵母单杂交筛选与其互作的元件；利用表达谱技术分析BplMYB46调控的下游代谢途径及靶基因。*后，确定白桦BplMYB46基因在响应非生物胁迫和次生细胞壁形成中的功能及调控机制，为白桦的遗传改良奠定基础。
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| 目錄：
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目录
前言
1绪论1
1.1植物基因启动子的研究进展1
1.1.1启动子的结构和功能1
1.1.2启动子的分类1
1.2植物转录因子的研究2
1.2.1转录因子的结构和分类2
1.2.2转录因子的活性4
1.2.3转录因子的功能4
1.2.4MYB转录因子的研究进展6
1.3本研究的目的和意义8
2白桦BplMYB46基因的表达研究10
2.1实验材料10
2.1.1植物材料10
2.1.2载体与菌株10
2.1.3主要试剂10
2.1.4药品及培养基制备11
2.2实验方法12
2.2.1BplMYB46转录因子的亚细胞定位12
2.2.2白桦BplMYB46基因分析16
2.2.3白桦BplMYB46基因的表达16
2.2.4BplMYB46启动子序列分析18
2.2.5BplMYB46启动子的时空表达分析18
2.3结果与分析22
2.3.1BplMYB46转录因子的亚细胞定位22
2.3.2白桦BplMYB46基因分析24
2.3.3白桦BplMYB46基因的表达24
2.3.4pCAMBIA1301-BplMYB46启动子序列元件分析27
2.3.5BplMYB46启动子的时空表达28
2.4讨论30
2.5本章小结31
3白桦BplMYB46基因的功能研究33
3.1实验材料33
3.1.1植物材料33
3.1.2载体与菌株33
3.1.3试剂33
3.1.4溶液及培养基制备34
3.2实验方法35
3.2.1BplMYB46基因植物过表达载体的构建和工程菌的制备35
3.2.2BplMYB46基因对白桦的遗传转化40
3.2.3BplMYB46转基因白桦在非生物胁迫下的抗逆分析42
3.2.4BplMYB46基因在白桦次生壁合成中的功能分析46
3.3结果与分析48
3.3.1BplMYB46基因植物表达载体的构建和工程菌的制备48
3.3.2转基因白桦的筛选与检测52
3.3.3BplMYB46转基因白桦苗非生物胁迫下的抗逆分析54
3.3.4BplMYB46基因在白桦次生壁合成中的功能分析65
3.4讨论69
3.5本章小结71
4BplMYB46转录激活结构域和同源蛋白的互作研究73
4.1实验材料73
4.1.1菌株与载体73
4.1.2常用试剂73
4.1.3药品及培养基制备73
4.2实验方法75
4.2.1BplMYB46转录因子转录激活结构域的研究75
4.2.2BplMYB46转录因子与同源基因互作的研究78
4.3结果与分析81
4.3.1BplMYB46转录因子转录激活结构域分析81
4.3.2BplMYB46转录因子与同源蛋白的互作83
4.4讨论86
4.5本章小结87
5BplMYB46识别顺式作用元件的研究89
5.1实验材料89
5.1.1菌株与载体89
5.1.2主要试剂89
5.1.3药品及培养基制备90
5.2实验方法91
5.2.1BplMYB46识别顺式作用元件的研究91
5.2.2BplMYB46与顺式作用元件的互作验证100
5.2.3染色质免疫共沉淀（ChIP）技术分析BplMYB46与下游基因的互作106
5.3结果与分析109
5.3.1BplMYB46识别顺式作用元件的分析109
5.3.2BplMYB46与顺式作用元件互作分析114
5.3.3ChIP实验结果分析117
5.4讨论118
5.5本章小结120
6BplMYB46调控下游基因的表达分析121
6.1实验材料121
6.1.1植物材料121
6.1.2常用试剂121
6.1.3溶液配制121
6.2实验方法121
6.2.1RNA的提取与反转录121
6.2.2数字基因表达谱文库的构建和测序122
6.2.3数据的处理122
6.2.4测序评估122
6.2.5基因表达量统计123
6.2.6差异表达基因筛选123
6.2.7RT-PCR方法验证表达谱测序结果123
6.3结果与分析125
6.3.1表达谱测序结果评估125
6.3.2差异表达基因分析129
6.3.3RT-PCR验证表达谱结果131
6.4讨论132
6.5本章小结133
7讨论与展望134
7.1讨论134
7.2展望136
参考文献137
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| 內容試閱：
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1绪论
1.1植物基因启动子的研究进展
1.1.1启动子的结构和功能
对多种基因启动子区的研究发现，大多数功能基因的启动子具有相同的结构模式，植物基因在一般情况下以A（腺嘌呤）为转录起始点，两侧多为嘧啶[1，2]，在–25～–30bp处为TATA框，–70～–78bp处为CAAT盒，–80～–110bp区为GC盒。TATA框上游的保守序列被称为上游启动子元件（UPE），这些序列和结构共同作用以确保转录精确而有效地起始。真核生物基因启动子的核心结构（corepromoter）在转录起始点–40～+50，能结合并调控转录起始前复合物的装配、确定转录起始位点并调控转录的方向、对胞内的激活子及抑制子做出应答的功能[3]，由RNA聚合酶指导转录的基因启动子主要包含一个TATA框和（或）起始子（Inr）。
1.1.2启动子的分类
按照基因的表达方式，启动子被分为组成型启动子（基因在植物中的表达不被某种物质诱导并无时空限制）、诱导型启动子（基因的表达可被某种物质诱导，无诱导物存在时基因表达水平很低甚至无表达）和组织特异性启动子（基因只在植物的某个组织或器官中表达）。
1.1.2.1组成型启动子
CaMV35S启动子*初是从烟草花叶病毒基因的启动子分离得到的，可以启动多数植物异源基因的表达，属于组成型启动子。分几个区段的启动子的研究显示，不同区段能够对基因表达产生组织特异性。A区（–90～+8bp）多在根或将发育为根的胚组织中表达，B区（–343～–90bp）多在地上部分表达。完整的CaMV35S启动子是植物基因工程应用*多的组成型启动子，在拟南芥[Arabidopsisthaliana（L.）Heynh.][4]、烟草（NicotianatabacumL.）[5]及毛白杨（PopulustomentosaCarr.）[6]等植物的转基因工作中都有广泛应用。
actin启动子是植物体内一个高表达的组成型启动子，actin基因编码的蛋白质属于细胞骨架的基本物质，因此这个启动子在所有组织中可能都有一定的活性[7]。Act1启动子是actin家族中应用*多的启动子之一，其起始转录的必要元件位于起始密码子上游的113kb区域内。水稻Act1基因的5′端有很多重复的短小元件：在559～570bp和608～619bp处分别有一个、–316～–345bp处前后有两个16bp的序列AAGCCCCTAAAGTGCCTA，其下游相隔20bp处重复接连8组保守的序列CCCAA和12bp的重复序列GGTTTTTAAGTT。位于重复元件下游的很多序列被证实能够调控基因表达，–146～–186bp是一个poly?A，40个中有35个碱基A。–35～–41bp是TATA框，它的3′端有一个79bp的外显子，GC丰富并包括很多重复序列ATCC三聚碱基。Act1基因5′端的内含子长313bp，对基因的表达有相当重要的作用，是它的**个内含子[8]。单子叶植物常用的组成型启动子还有玉米泛素基因（ubiquitin）的启动子等。
1.1.2.2诱导型启动子
植物受不同信号刺激，据此启动子主要分为物理、化学和生物因素诱导表达的启动子。
1.1.2.3组织特异性启动子
受启动子调节的基因转录一般只发生在某些特定组织或器官中，呈现发育调节的特性。
1.2植物转录因子的研究
1.2.1转录因子的结构和分类
转录因子（tran******ionfactor，TF），亦称反式作用因子，是一类能与真核生物基因启动子的顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间及与其他相关蛋白质之间的相互作用，激活或抑制转录。根据蛋白质的结构，转录因子主要具有4个功能域，为DNA结合域（DNA-bindingdomain）、转录调控域（tran******ionregulationdomain，包括激活域和抑制域）、寡聚化位点（oligomerizationsite）和核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS）。转录因子通过这些功能域，在特定的时间进入细胞核与启动子顺式作用元件或其他转录因子的功能域相互作用来调控基因的转录表达[9]。
在真核生物中，mRNA的转录起始是一个非常复杂的过程，在基因表达中起调控作用的顺式作用元件由启动子和DNA调控序列组成。基因的转录起始涉及很多转录因子，这些转录因子可以分为两类，包括普遍性转录因子（generaltran******ionfactor）和特异性转录因子（specifictran******ionfactor）。目前，在真核生物中分离到的普遍性转录因子有TFⅡA、B、D、E、F、（GJ）、H和I，主要作用是在启动子的TATA框与RNA聚合酶Ⅱ组装成转录起始复合物，从而激活所有基因的转录。特异性转录因子也是一种DNA结合蛋白，它和DNA上其他调控元件结合，只激活特定的基因转录[10]。特异性转录因子根据DNA结合域的不同分为不同种类，如MYB类、bZIP类、ERF类、WRKY类等，详细信息见表1-1。其中，一些结构域还可根据其特征区中保守的氨基酸残基的数目和位置划分为几个亚类，如根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基的数量和位置，将含锌指结构域的转录因子分为C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2、C2C2C2C2等亚类[11]。
表1-1植物转录因子DNA结合域的特点
1.2.2转录因子的活性
转录因子的活性受很多因素的影响，包括转录后修饰、在细胞中的位置及与其他蛋白质的互相作用等。转录后修饰对调控转录因子的活性有着十分重要的作用。转录后修饰主要表现在对蛋白质的磷酸化修饰上，它不仅可以调节转录因子进入细胞核的过程，还可以改变转录因子的活性及其与DNA的结合能力。例如，调节玉米种子醇溶蛋白基因表达的转录因子O2，具有8个能够结合氨基酸的位点，能被酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）磷酸化，其中转录激活区内就有6个。O2有多种磷酸化、非磷酸化或低磷酸化形式能与DNA结合，而高磷酸化形式缺乏与DNA结合的能力，这进一步验证了O2磷酸化比例与昼夜变化紧密相关，进而来调控基因的转录活性，以确保蛋白质定时、定量的合成[12]。
转录因子是在细胞核内发挥其功能的，所以，对其进入细胞核过程的调节至关重要。转录因子进入细胞核是主动运输的过程，首先通过核定位信号区与受体蛋白之间相互作用，然后与位于核孔处的亲核蛋白结合，借助亲核蛋白通过核孔复合体进入细胞核内。没有核定位信号区的转录因子靠与具有核定位信号区的转录因子发生作用进入细胞核[13]。
转录因子的活性还与其他蛋白质间的相互作用有关。转录因子之间通过寡聚化区发生作用，对它们与DNA的结合方式、能力和在细胞中的位置进行调节。
1.2.3转录因子的功能
1.2.3.1转录因子与植物抗逆
植物逆境胁迫包括生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要为病虫害、杂草等，非生物胁迫主要为干旱、高盐碱、水涝、高温及冻害等。在胁迫刺激下，一些转录因子过量表达，将信号传递和放大，调控相应的下游功能基因的表达，从而提高植物的抗逆性[14]。
与植物逆境相关的转录因子主要有AP2EREBP类、bZIP类、WRKY类、bHLH类、MYB类和NAC类基因家族。其中，CBF（C-repeatbindingfactor）转录因子为碳亚基结合因子，属于AP2EREBP中很重要的一类，主要和低温胁迫密切相关。Oakenfull等学者首先克隆并获得了生长在北极的欧洲越橘的CBF基因，构建过表达载体后将其转入拟南芥中，结果发现欧洲越橘的CBF过表达能够提高拟南芥的抗寒能力[15]。Lee和Thomashow在拟南芥中发现3个与光周期相关的CBF基因，在长日照条件下，光敏色素B（phytochromeB）和光敏色素交互因子（phytochrome-interactingfactor）使CBF基因表达量下降，而在短日照条件下，CBF基因被抑制表达的情况被解除，表达量急剧升高，*后得出结论：这3个CBF基因短日照情况下在拟南芥中的表达量高于长日照情况下，从而提高在短日照情况下拟南芥的抗低温能力[16]。ERF转录因子也属于AP2EREBP中的一类，Xiong等[17]在油菜中找到一个ERF基因，发现在低温、干旱、高盐和ABA的胁迫下油菜中ERF基因的表达量和未处理的相比有所上调，于是将此基因进行定点突变，突变后增强了ERF基因与一个低温胁迫元件结合的能力，将ERF基因和突变的ERF基因分别转入拟南芥中，结果发现ERF基因过表达的转基因拟南芥的抗寒能力高于野生型拟南芥，而突变的ERF基因过表达的转基因拟南芥的抗寒能力优于ERF基因过表达的转基因拟南芥。
bZIP转录因子也是一类重要的转录因子，参与植物体内的基因表达及调控。Lee等在甜椒中获得一个bZIP转录因子，它能够被一些非生物刺激和逆境诱导，把它构建到过表达载体中后转入拟南芥，结果发现转基因拟南芥在整个生长阶段抗干旱和高盐能力有很大提高[18]。Lu等在水稻中发现一个OsbZIP72转录因子，它能够被ABA信号途径诱导，并且通过酵母杂交实验发现此转录因子能够与ABRE元件结合，转OsbZIP72基因水稻显示了对ABA的超敏性，实验结果表明OsbZIP72能通过ABA信号途径诱导提高水稻的抗干旱能力[19]。
WRKY蛋白是一类植物所特有的转录因子超家族，在植物抗逆过程起着关键的作用。Wang等学者在葡萄中发现一些WRKY转录因子，实时荧光定量PCR结果发现有36个WRKY转录因子的表达水平在低温诱导下发生了变化，鉴定出15个转录因子确实与低温胁迫相关，其中有3个基因与ABA信号转导途径紧密关联[20]。Tripathi等做了WRKY转录因子在干旱响应下的综述性研究，因为在干旱胁迫情况下一般都伴随着高温胁迫和密集强度的光照，所以研究WRKY转录因子在干旱胁迫下的表达模式非常重要[21]。Jiang和Deyholos在拟南芥中发现两个与高盐胁迫相关的WRKY25和WRKY33转录因子，将它们转入拟南芥后提高了拟南芥的耐盐能力，并分别鉴定了WRKY25和WRKY33转录因子下游的31个和208个启动子，在这些启动子序列中包含大量的W-box元件[22]。
bHLH类转录因子及同源物是植物基因组的一个大家族，参与植物中多种生理生化反应过程，但bHLH类转录因子在植物中的功能被解析得还不是十分透彻[23]。近些年，bHLH类转录因子被研究得比较多，Jiang等在拟南芥中得到一个bHLH92基因，观察到在高盐、干旱和低温胁迫下，bHLH92基因有丰富的转录水平，并且利用微阵列技术获得了在高盐胁迫下bHLH92基因作用的19个下游靶基因[24]。
MYB类转录因子是数量**、功能*多的转录因子家族之一，在植物胁迫应答中起着重要的调节作用。拟南芥的AtMYB68能够抵抗高温胁迫[25]，AtMYB2的耐寒能力显著增强[26]，水稻Osmyb4基因的过表达大大提高了转基因水稻对干旱、高盐、紫外辐射等的耐受能力[27]。NAC转录因子参与多种植物生物和非生物胁迫反应、激素信号转导途径等过程，对于植物的生长发育起到关键的调节作用[28]。Zhu等在西红柿中获得一个SlNAC4基因，实验结果证明，SlNAC4基因能够抵抗高盐和干旱胁迫的逆境生长环境[29]。Liu等学者在水稻和棉花中发现一个逆境胁迫相关的SNAC1，实验证明它能通过增强根的发育和减少蒸腾速度来抵抗高盐和干旱胁迫[30]。
从以上研究可以看出，转录因子在植物抗逆方面的作用是很重要的，但很多时候，单独的一个转录因子并不能完全起到抗逆作用，需要多个转录因子共同作用才能完成。Xu等在葡萄中获得2个bHLH基因，将它们转入拟南芥后通过正向调节CBF基因的表达，增强了拟南芥抗低温耐力[31]。Hemsley等在拟南芥中发现3个MED（调节复合体亚基）基因能
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