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| 編輯推薦： |
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《高级生物化学实验理论与技术》可供硕士研究生课程学习使用，也可作为博士研究生、青年科研工作者和医学生们参考资料。
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| 內容簡介： |
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《高级生物化学实验理论与技术》理论部分共有六章，第一章是蛋白质分离纯化的基本原理和方法，主要介绍蛋白质的粗分和层析纯化。第二章是电泳，主要介绍常用的电泳方法。第三章是荧光免疫，主要介绍荧光标记和抗原抗体反应。第四章是蛋白质组学，介绍蛋白质组学的产生和发展，研究内容以及一些新进展和应用。第五章是基因芯片，主要介绍基因芯片的原理，制备和应用。第六章是酶促反应动力学，重点介绍底物和抑制剂对酶促反应的影响，相关的计算及各种作图法。实验部分的内容包括蛋白分离技术、电泳及蛋白质印迹技术、酶活性测定、K及IC的测定、等电聚焦、双向电泳、小鼠原代细胞培养及染色等八个实验。其中层析和电泳是重点要求掌握的实验，其他实验可选择开设。
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| 目錄：
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目录
第一篇实验理论
第一章蛋白质分离纯化的基本原理和方法1
第一节材料的选择与处理1
第二节纯化方案的设计与评价2
第三节纯化方法4
第二章蛋白质电泳的基本原理和方法24
第一节概述24
第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳29
第三节SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳38
第四节等电聚焦40
第五节毛细管电泳44
第六节印迹法转移电泳47
第三章免疫荧光50
第四章蛋白质组学55
第一节蛋白质组学的产生与发展55
第二节蛋白质组学的研究方法57
第三节蛋白质组学在疾病研究中的应用69
第五章基因芯片71
第一节基因芯片的概述71
第二节基因芯片的基本原理72
第三节基因芯片的应用79
第六章酶促反应动力学85
第一节酶促反应85
第二节酶促反应的影响因素89
第三节抑制反应动力学94
第二篇实验技术
实验一离子交换层析等方法分离纯化鸡卵黏蛋白103
实验二胰蛋白酶活性测定及鸡卵黏蛋白抑制试验105
实验三胰蛋白酶抑制剂对反应速度的影响？抑制剂类型的判定及Ki？IC50的测定106
实验四苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定110
实验五SDS￣聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹113
实验六聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法117
实验七蛋白质的双向电泳120
实验八小鼠原代肝细胞培养及油红“O”染色123
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| 內容試閱：
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第一篇实验理论
第一章蛋白质分离纯化的基本原理和方法
随着人类基因组的30亿碱基对测序工作的完成，生命科学研究已进入后基因组时代，研究的焦点将从基因的序列转移到功能方面？为鉴定大量未知蛋白质酶的结构和功能，蛋白质研究也将进入一个空前活跃的时期？蛋白质的结构与核酸相比更具有奇妙独特的复杂性和艺术性，它是由20个不同性质的氨基酸交互排列而成，不仅潜在的数量多，而且相互间差异大？致使蛋白质的分离？纯化和鉴定有较大的难度和特殊性？其次，蛋白质和核酸类物质通常是与自然界存在的诸多不同化合物结合在一起，或者是不同蛋白质？不同核酸白身相互组合在一起出现的，加之它们稳定性较差？含量相对偏低，这使提取分离过程变得更加困难？艰巨？另外提取生物大分子物质的材料五花八门？千变万化，所用的方法通用性较差，尤其是提取分离蛋白质的方法更是如此，这也给制备工作带来了麻烦和困惑？尽管如此错综复杂，却也不是无轨迹可寻？因此，本章将以蛋白质为主线讨论其制备的共有特质和一般过程，其中包括材料的选择与处理？测定方法的确立？有效成分的抽提？粗品的纯化和纯品的鉴定等相关步骤？
第一节材料的选择与处理
一？材料选择
在进行材料的选择时，常会提及有效成分一词？所谓有效成分是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质？而有效成分以外的其他物质则统称杂质？在动物？植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少，如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一？此外，有效成分稳定性较差，大多数对酸？碱？高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，而且容易被微生物分解变质？因此，提取有效成分的成功与否，首先与选用的材料关系密切？选用的材料如果不同，有效成分的含量就不一样；选用的材料即使相同，但是部位？生长期？生长地区或存放时间不同，有效成分的含量也不尽相同？总的来说，材料选择应遵循的原则是:有效成分含量多？稳定性好；来源丰富？保持新鲜；提取容易？工艺简单；杂质有综合利用价值等？例如，上面提到的胰岛素，从含量看，牛胰脏中比猪胰脏中高，但从我国实际出发，全国猪的饲养头数远比牛多，加之牛可拉车？耕田，因此制备胰岛素一般不选用牛胰脏而选用猪胰脏作材料？又例如磷酸单酯酶，就含量而言，虽然在胰脏？肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开，所以实践中常选用含磷酸单酯酶少？几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料？
二？材料处理
选择到合适的材料后，应及时使用，否则所需的有效成分会部分甚至全部被破坏变性，从而影响得率？例如，从猪肠黏膜提取肝素时，如果用新鲜材料，每公斤小肠可得肝素钠5万~6万单位？如将材料置25℃以上的室温存放约工h，肝素钠的含量会显著下降？其原因是，猪小肠内的大量微生物不停地繁殖如大肠杆菌约20min繁殖一次，有的会产生降解肝素的酶系？若选择的动物材料难于立即使用时，应及时移至-20℃冰库可短时间保存或-70℃低温冰箱数月不变质储存，或者干燥等方法处理，同时还应将易于去掉的非需物质如脂类除去，该物质不仅容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率？若选择由室内栽培或野外采集的植物材料，当是植物的叶片如菠菜？芹菜，需用清水洗净方可使用，或置-30-4C冰箱储藏，可在lOh内使用；当是植物的种子，则需泡涨或粉碎后才可使用？如材料中含油脂较多时，也要进行脱脂处理？由于微生物具有种类多？繁殖快？培养简便？诱变容易和不受季节影响等优点，因此，它已成为制备生命大分子物质的主要材料之一？当选用的微生物接种于适当的培养液培养一段时问后，用离心法收集到的上清液即可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分？
第二节纯化方案的设计与评价
纯化方案是指在纯化某一物质过程中，根据实际情况将几种分离方法如沉淀法？离子交换层析？葡聚糖凝胶等有机地互补联用？灵活调节的总称？它既是从各类材料中提取分离有效成分的基础，又是成功地达到纯化目的的一条必经之路？因此，只有潜心设计一个合理？实用？周密的纯化方案，才能在操作时得心应手？事半功倍？
一？纯化方案的设计
鉴于纯化方案是由几种分离方法组成的，因此，设计纯化方案时，首先要选择分离方法？一般选择分离方法多半是依据抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性？例如，沉淀法是从有效成分与杂质之间溶解度的差异性着眼的；而离子交换层析法？凝胶过滤法和亲和层析法则分别是从有效成分与杂质之间电荷？分子质量和对配体亲和力的差异性分析的？根据这些原理，为纯化某一有效成分可结合其特性，从诸多分离方法中反复比较，认真权衡，仔细筛选i出两种？两种以上乃至更多种方法，组成一个满足需要的？合适的纯化方案？其中各分离方法的排布顺序，通常应当选用先粗处理？快速？有利于缩小样品体积的方法，而精确？费时和需样品量少的方法，则适宜盾面使用？虽然分离方法的基本原理各具特色，操作程序繁简不一，利弊得失有多有寡表1-1-1？但是，只要认真分析有效成分的特性和结构及所用材料的特点，深入理解各种分离方法的原理和用途，合理？巧妙地设计纯化方案，就能从成分复杂？相互混合的抽提液中提取纯化m一种单一的有效成分？最后还有两点要提醒:一是在一个纯化方案中，切忌一种分离方法重复使用，否则，不但不能提高纯化倍数，反而会降低回收率；二是初期设计的提纯方案，并非一成不变，而是在试验中，往往需要对整个方案及所属的方法包括相关细节进行不断地修正？调节，才能日趋完善？
表1-1-1几种主要分离方法的比较
二？纯化方案的评价
对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价？而这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出？其方法是，对纯化过程的每一步收集到的溶液都要进行有效成分的含量测定，并将各白的比活性活性单位数毫克蛋白？纯化倍数每步的比活性粗抽提液的比活性和收得率每步的总活性粗抽提液总活性×100%计算出来？视纯化倍数的大小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值？一般认为，凡是在特定实验中能较快增大纯化倍数和较缓慢降低收得率的方法均属于有应用价值的？反之，则应用价值不大，也不宜采用？但是，在纯化过程中，随着纯化倍数的增大，有效成分的含量却是逐渐减少，收得率也往往小于100%除非抽提液中存在酶的抑制物？因此，实践中对纯化倍数和收得率的要求是根据材料来源的难易而变化的？若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数？下面以从赛氏杆菌Serrat iasp.提取L-天冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率之间的关系表1-1-2？
表1-1-2L.天冬酰胺酶纯化
从表1-1-2看出，分离纯化操作是一个比较复杂的过程，欲从赛氏杆菌中提取分离出L-天冬酰胺酶需要分7步完成，其中包括细胞破碎？选择性沉淀？硫酸铵分级？离子交换层析？吸附层析？凝胶电泳等方法？也就足说，这个纯化方案是由7种分离方法组合起来的？从粗酶液粗抽提液到纯酶液，每步的纯化倍数都在有序增加，最后的纯化倍数为365，而每步的收得率却都在逐渐下降，最后仅为15%，其中损失占85%？这反映出，本纯化方案中所列分离方法的选择？组合和排列是适当的？在此期间，总蛋白量共降低2500倍，而酶总活性只降低6.7倍？这表明杂蛋白比酶蛋白降低快得多，因而L-天冬酰胺酶得到了纯化？此处酶含量用活性单位表示，纯度用比活性表示；如纯化的物质是胰岛素，其含量将用效价表示，纯度用每毫克蛋白质所含效价单位表示？总之，纯化的有效成分不同，表示其含量和相对纯度的单位亦不一样？
第三节纯化方法
一？沉淀法
沉淀法是纯化生命大分子物质常用的一种经典方法？该法操作简单？成本低廉，一般包括盐析沉淀？有机溶剂沉淀和选择性沉淀等类型？
一基本原理
沉淀法也称溶解度法？其基本原理是根据各种物质的结构差异如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异等来改变溶液的某些性质如pH？极性？离子强度？金属离子等，就能使抽提液中有效成分的溶解度发生变化？换句话说就是不同的物质置人相同溶液，溶解度是不同的；相同的物质置人不同的浴液，溶解度也是不一样的？因此，选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度？然后经过适当处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的？
二制备方法
1.盐析法蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升盐溶，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出盐析？盐析的发生是由于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出？盐析法一般是采用分级沉淀法进行操作的，常选用的盐是硫酸铵，因为硫酸铵与其他盐如氯化钠？硫酸钾等相比，有溶解度大，对温度不敏感等优点？如果选择的分级范围为25%~60%饱和度的盐溶液，其操作步骤是，首先选择0~25%饱和度盐溶液，使部分杂质呈“盐析”或沉淀状态，有效成分呈“盐溶”溶解状态？经离心分离后得到上清液，再选择25%~60%饱和度的盐溶液，使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质？这也是蛋白质进行分级沉淀时常用的一种操作步骤？
2.有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二:其一，与盐溶液一样县有脱水作用；其二，有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性变小？常用的有机溶剂是甲醇？乙醇和丙酮等？由于有机溶剂加入水溶液时，产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把有机溶剂预冷至-100C，而且整个操作要在低温下进行？另外加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果？但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用？因此，用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行？
3.蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用？
1碱性蛋白质:多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效地沉淀核酸物质外，还能沉淀某些蛋白质？当把90mg鱼精蛋白加入部分纯化的酵母磷酸果糖激酶溶液含lg蛋白质时，溶液中的酶蛋白便吸附到鱼精蛋白-核酸沉淀物上？沉淀物用0.ImolL磷酸缓冲液洗脱后，收得的磷酸果糖激酶的纯度比原来提高了9倍？但是，多价阳离子碱性蛋白质移去阴离子物质的反应多半是不可逆的，故使它的应用受到了限制？再者，由于多价阳离子物质的水溶液pH为2~3，所以要小心地中和后，才可加到蛋白质溶液中？
2疑集素:如植物凝血素，它是一种特殊的蛋白质？该物质对糖蛋白中糖链的末端序列具有明显？特异的凝集力？例如，伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖？甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开？获得的凝集素糖蛋白复合物，用单糖作抑制剂就能使其解离？该沉淀法的优点是反应条件较温和，专一性强，因此研究者颇多？
3重金属盐:如铅盐？汞盐作为蛋白质沉淀剂，也能使蛋白质或酶得到纯化？由于重金属会使蛋白质变性，因此应用时要控制在较温和的条件下进行，并要及时通过透析方法把蛋白质与重金属尽快分开？
4.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇polyethyleneglycol，PEG和右旋糖苷硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用？这种沉淀的条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较完全，因此应用范围颇广？但是，它也受各种因素如pH？离子强度？蛋白质浓度及聚合物分子质量的影响？Honing等的试验表明，沉淀作用较满意的聚合物是分子质量在400~6000Da的PEG？当从卡尔斯伯酵母菌提取仪一葡萄糖苷酶时，将盛其抽提液的离心管置冰浴，加入20%PEG6000或57%PEG400，立即在旋涡仪上振荡混合，再置冰浴15~18h，10000rmin离心lhOoC，倾去上清液，沉淀物溶在lOmmolL磷酸缓冲液pH6.8中，葡萄糖苷酶的回收率在80%左右？就葡萄糖
……
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