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| 編輯推薦： |
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《基因沉默理论与技术》可供生物医学专业研究生、本科生及从事基因沉默研究的科研人员阅读和实验时参考。
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| 內容簡介： |
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《基因沉默理论与技术》是《21 世纪生物技术系列》的一个分册。《基因沉默理论与技术》系统地介绍了基因沉默的概念、原理、运用，以及不同的基因沉默技术的理论与技术细节。对基因沉默进入深入研究，可帮助人们进一步揭示生物体基因遗传表达调控的本质。利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达，可达到治疗疾病的目的；在功能基因组方面，通过有选择地使某些基因沉默，可以测知这些基因在生物体基因组中的功能。基因沉默技术具有巨大的潜在应用价值。
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| 目錄：
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第一章 基因沉默概论 1
第一节 基因沉默的概念?发现及分类 1
第二节 基因沉默的原理及发生 1
第三节 研究基因沉默的意义 4
第四节 基因沉默的应用 5
第五节 展望 5
第二章 基于化学合成法的siRNA 干扰技术 6
第一节 什么是siRNA 6
第二节 靶序列确定及化学合成方法 8
第三节 siRNA 转染细胞的方法及注意事项11
第四节 siRNA 有效片段筛选意义和方法 13
第五节 siRNA 干扰效率检测与效果评价 14
第六节 siRNA 在生物医学中的应用 14
第七节 问题与展望 15
第三章 microRNA 沉默靶基因及其应用 18
第一节 microRNA 的发现和基本概念 18
第二节 microRNA 的结构与形成 18
第三节 microRNA 与疾病 19
第四节 microRNA 与siRNA 的区别 20
第五节 microRNA 的研究手段 21
第六节 microRNA 功能分析确定 22
第七节 microRNA 表达检测 23
第八节 microRNA 研究展望 25
第四章 siRNA 技术构建G6PD 缺陷型A375 稳转细胞株 26
第一节 G6PD 缺陷型A375 稳转细胞株的构建方法 26
第二节 A375-G6PD 稳转细胞株的功能检测 30
第三节 A375-G6PD 稳转细胞株的应用 30
第五章 基于PENK 基因干扰克隆载体构建的RNA 干扰技术 30
第一节 实验原理与实验目的 32
第二节 实验设备?试剂 32
第三节 实验步骤 34
第六章 α-突触核蛋白干扰技术 42
第七章 人类免疫缺陷病毒转染皮质神经元 64
第八章 单纯疱疹病毒转染原代皮质神经元和脊髓神经元 71
第九章 腺病毒转染原代皮质神经元和脊髓神经元 88
第十章 基因敲减理论与实验技术 93
第一节 基因敲减技术发展简史 93
第二节 基因敲减的概念 95
第三节 基因敲减的原理 95
第四节 基因敲减的应用前景 97
第五节 展望 97
第十一章 基因组编辑技术 98
第一节 显微注射技术 98
第二节 胚胎移植101
第三节 转基因动物制作104
第四节 基因打靶介导的敲除和敲入动物的制作108
第五节 转座子技术在基因修饰中的应用116
第六节 TALEN 技术介导的敲除动物的制作118
第七节 CRISPRCas 技术介导的基因敲除动物的制作120
第八节 克隆动物制作123
第十二章 调控eIF-5A1 的microRNA 预测与验证129
第一节 eIF-5A1 靶microRNA 的生物信息学预测129
第二节 eIF-5A1 靶microRNA 荧光素酶报告实验验证134
彩图
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| 內容試閱：
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第一章 基因沉默概论
第一节 基因沉默的概念、发现及分类
一、基因沉默的概念
1986 年，在烟草植株中高表达反义nos RNA，引发了nos 基因沉默，因为它由反义RNA 引发，所以称为反义沉默。RNA 和蛋白质在生物体中共同负责基因的表达和基因表达的调控，在生命活动中具有重要的作用。而转基因植物和转基因动物中往往会遇到这样的情况，外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低，这种现象就称为基因沉默。
基因沉默（gene silencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达，是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。在染色体水平，基因沉默实际上是形成异染色质（heterochromatin）的过程，被沉默的基因区段呈高浓缩状态。一方面，基因沉默是遗传修饰生物体（genetically modified organism）实用化和商品化的巨大障碍；另一方面，基因沉默是植物抗病毒的一个本能反应，为用抗病毒基因进行植物工程育种提供了具有较大潜在实用价值的策略——RNA 介导的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance，RMVR）。
二、基因沉默的发现
基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、昆虫、原生动物及小鼠中陆续发现。大量的研究表明，环境因子、发育因子、DNA 修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰及基因的过度转录等都与基因沉默有关。
三、基因沉默的分类
根据基因沉默发生的部位可以分为三类：位置沉默，发生在染色体DNA 水平；转录沉默，发生在RNA 转录水平；共抑沉默，发生在转录后水平。
第二节 基因沉默的原理及发生
基因沉默发生在两种水平上，一种是由于DNA 甲基化、异染色质化及位置效应等引起的转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）；另一种是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），即在基因转录后水平上通过对靶标RNA 进行特异性降解而使基因失活。在这两种水平上引起的基因沉默都与基因的同源性有关，称为同源依赖性的基因沉默（homology-dependent gene silencing，HDGS）。发生沉默的基因可以是外源性转移基因，也可以是入侵的病毒或宿主内源性基因。研究发现，环境因子、发育因子、DNA 修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰及基因的过度转录等均与基因沉默有关，双链RNA（dsRNA）作为启动因素或中间体为不同生物基因沉默所共有。
PTGS 在多种生物中有共性，人们对PTGS 的激活和与其相关的RNA 降解调控过程有了初步的认识，也发现植物病毒在转基因植物和非转基因植物中都能和转基因一样诱发转录后基因沉默。令人吃惊的是，转基因植物的共抑制现象（转基因与同源的内源基因一起失活）、转基因植物的病毒抗性和非转基因植物对病毒正常自然侵染的抗性、真菌的阻抑（quelling）现象（真菌中的共抑制）、各种动物的RNA 干扰（RNA interference，RNAi）及转座因子的转座失活等这些表面看来完全不相关的现象中竟然存在着非常相似的基因沉默机制，即PTGS。这种基因沉默可能是生物体的本能反应，因为无论是转基因、转座因子还是病毒，对植物而言都是诱发突变的外来侵入的核酸，植物为保护自己，在长期的生物进化中，形成了基因沉默这种限制外源核酸入侵的防卫保护机制。在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，RNAi 敏感性缺失突变体中转座子的转座活性增强，表明转座子的转座失活是被一种类似PTGS 的过程调控的，这一过程与RNAi 作用有关，是通过细胞内双链RNA 互作引起同源特异性的RNA 降解。
PTGS 中的RNA 在细胞质中的特异性降解并不需要RNA 结合到核糖体上，这与通常的RNA 降解代谢调控需要与翻译相关联不同。对RNAi 激发的RNA 特异性降解机制进行了体外研究，发现通过添加外源的双链RNA 或靶标mRNA 可以激活PTGS，这与早期在植物中发现的双链RNA 介导PTGS 一致。通过对发生PTGS 的转基因植物进行嫁接实验和分析植物病毒病的恢复现象观察到，PTGS 是一种系统性的过程，称为系统获得性沉默（systemic acquired silencing，SAS）。PTGS 的系统传播性在真菌和线虫中也得到了证明。进一步研究发现，转基因或病毒侵染介导的PTGS 植物中普遍存在着大量的序列特异性正义和反义的大约25 个核苷酸的小分子RNA，而正常的非转基因植物和没有发生PTGS 的植物中则没有。这些小分子RNA 作为信号分子，在植物中与特定的运输蛋白特异结合，防止被核酸酶降解，通过胞间连丝和韧皮部筛管运送到植物体的各个部位，使PTGS 具有系统性、持久性。这一运转过程与植物病毒在植物体内的运输有着十分相似的机制。这些25nt RNA 的积累需要转基因的转录或病毒的复制，与其他双链RNA 等多种异常RNA 相比，25nt RNA 对于PTGS 的激发、靶标RNA 的特异性降解及PTGS 的系统性维持更为重要。
早在20 世纪70 年代初人们就发现，病毒或类病毒侵入植物后，RNA 依赖性的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的活性明显提高。RdRP 是生物体内普遍存在的一种RNA 聚合酶，在体外能以单链RNA 或单链DNA，甚至以双链RNA 为模板，合成与模板互补的RNA（cRNA），合成的cRNA 可长达100 个核苷酸。1993 年，Lindbo 等认为在PTGS 植物中的RdRP 与PTGS 同源依赖性的RNA 特异性降解有关。
而Mourrain 等从缺失转基因介导的PTGS 拟南芥突变体中分离的sgs2（suppressor of genesilencing）和sde1（silencing defective）两个基因与番茄中的RdRP 基因十分相似，支持了Lindbo 的观点。粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的qde-2（quilling-defective gene）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的rde-1（RNA interference-deficient gene）与番茄的RdRP基因也具有很高的同源性。RdRP基因剔除实验证明，RdRP对RNAi和PTGS尤为重要。这些研究结果表明，从比较低等的生物藻类、真菌到高等的植物再到动物线虫、锥虫、果蝇等中可能存在着一个由共同祖先进化来的相似的、抵抗外来DNA 侵入自身基因组的本能防卫机制。
RNAi 引发的PTGS 作为生物体中一种不完全的原始的生物免疫系统，在植物抗病毒中研究得比较详细。研究发现，植物病毒的RNA 可以直接作为PTGS 的激发子，并且可能通过病毒来源的基因引发转基因植物对病毒的终生系统抗性，这和PTGS 从病毒侵染点传播到整个植株及线虫中PTGS 的系统性一起证明了PTGS 具有系统传播性。拟南芥PTGS 突变体sgs2 和sgs3 对黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）的敏感性提高了，而突变体sde1 对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）的敏感性无变化。Baulcombe 研究组认为RdRP（sde1 或sgs2）对于引发产生PTGS 的双链RNA 是必需的，有些RNA 病毒在复制中用自身的RdRP 合成双链RNA 直接进入PTGS 网络，而不需要寄主的RdRP 激活PTGS，这些病毒如TMV、TRV 能在PTGS 突变体中和野生型中一样致病，而另一些病毒如CMV 需要寄主的RdRP来激活PTGS，所以PTGS 突变体对这些病毒的敏感性要比野生型的高。另外，CMV 还可能与有些病毒产生的抑制PTGS 的蛋白质有关，如CMV 和番茄不孕病毒（tomatoaspermy virus，TAV）的2b 蛋白及马铃薯Y 病毒（potato Y virus，PVY）的蚜传辅助因子（helpercomponentprotease，HC-Pro）有关等。由此可见，不同的RNA 病毒是通过不同的位点进入并引发PTGS 网络的。由于拟南芥PTGS 突变体是通过转基因介导的PTGS筛选的，突变体对不同病毒敏感性的变化，也可能表明转基因和病毒侵染引发植物PTGS的机制是有差别的。在突变体sde1 中，与PTGS 有关的25nt 转基因特异性的RNA 的积累明显减少，而病毒特异性的25nt RNA 的量不变，这也表明转基因和侵染病毒是通过不同途径引发PTGS 的。
从大量的研究结果中可以推测，生物体内有一套RNA 监视系统，可以通过多种异常RNA 来激发。如果外来核酸是DNA（包括转基因、重组基因、DNA 病毒、扩增子等），靶标RNA 需要在细胞核中完成转录后运转到细胞质中，而侵入细胞质的病毒RNA 可以直接提供靶标RNA。各种不同的靶标RNA（包括与外源基因同源的内源基因和外来的DNA 产生的RNA 及病毒的RNA）由寄主的RdRP 或病毒自身的RdRP 通过多种不同的途径将靶标RNA 转变成为双链RNA，从而通过RNAi 引发PTGS。PTGS 被引发后就不再需要RdRP。关于双链RNA 介导的RNAi 特异性靶标RNA 的降解，Bass 提出了这样一个假说：认为生物体内存在着一种复合酶——RNAi 核酸酶，该酶具有双链RNA 结合区、RNase 和RNA 解旋酶3 个活性区。首先双链RNA 结合到该酶的双链RNA 结合区并引导该酶识别靶标RNA，然后该酶的RNA 解旋酶完成ATP 依赖性的靶标RNA 与该酶结合的双链RNA 的正义链的换位，RNase 在靶标RNA 结合位点附近完成切割，从而使靶标RNA 能被进一步降解，产生大量的小片段RNA，包括序列特异性的25nt RNA。载有序列特异性的双链RNA 的游离复合酶再去识别并降解其他的靶标RNA，产生更多25nt RNA，从而使PTGS 具有系统性、持久性。
基因沉默需要经历不同的反应过程才能实现，包括组蛋白N 端结构域的赖氨酸残基的去乙酰基化加工、甲基化修饰[由甲基转移酶催化，修饰可以是一价、二价和三价甲基化修饰，后者又称为“过度”甲基化修饰（hypermethylation）]，以及和甲基化修饰的组蛋白结合的蛋白质（MBP）形成“异染色质”，在上述过程中，除了部分组蛋白的N 端尾部结构域需要去乙酰化、甲基化修饰之外，有时也许要在其他的组蛋白N 端尾部结构域的赖氨酸或精氨酸残基上相应地进行乙酰化修饰，各种修饰的最终结果会导致相应区段的基因“沉默”失去转录活性。这个“原则”就是目前尚没有真正完全清楚的“组蛋白密码”（histone code）。能够与甲基化组蛋白结合的蛋白质有Sir1～Sir4，这是一组称为“silencing informative repressor”的蛋白质，其中，Sir2 就是“去乙酰化”酶，而Sir1、Sir3 和Sir4 则负责与甲基化修饰的组蛋白结合“沉默”相应的染色质为异染色质。此外，基因沉默也和DNA 的甲基化修饰有关。例如，在真核生物基因组中许多基因的5′端分布有长约1kb 碱基对的“CpG”岛序列（CpG island），其中的“C”芳香环5位可被甲基化修饰，之后，与甲基化修饰的DNA 结合蛋白形成“沉默”区段，使其下游基因不能表达。另外，非编码的RNA 分子（non-coding RNA）也参与“基因沉默”过程。这一类型常见于含有重复DNA 序列的染色质区，如着丝粒部位的基因沉默就需要非编码RNA 分子的参与。简言之，基因沉默涉及组蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化，DNA 的甲基化修饰，甲基化修饰组蛋白结合蛋白Sir2～Sir4，甲基化DNA 结合蛋白，非编码RNA
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