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DNA测序简介
Stuart M. Brown
DNA测序简史
人类基因组计划(Human Genome Project,HGP,1995~2003)中所有DNA测序工作都是通过Frederick Sanger在1975年发明的测序法加以改进而完成的(Sanger and Coulson 1975)。在Sanger的工作之前,部分核苷酸序列通过RNA合成和酶消化的点对点(ad hoc)方法测定。1971年康奈尔大学的Ray Wu发表过类似Sanger法的测序法(Wu and Taylor 1971),他通过DNA聚合酶向单链末端增加带有放射性标记的互补核苷酸,用酶切反应和色谱法等一系列方法,成功测定了噬菌体λDNA单链末端的12个碱基。1973年,Walter Gilbert 和Allan Maxam发表了大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中乳糖操纵子(转录阻遏物结合位点)的24个碱基序列(Gilbert and Maxam 1973)。他们使用了一系列复杂的混合方法,包括部分酶切消化的嘧啶指纹、色谱法和体外转录RNA分子的酶切反应等。比利时根特大学的Walter Fiers和同事测定了噬菌体MS2外壳蛋白的所有序列(Min Jou et al. 1972)。该方法基于噬菌体RNA的核酸酶消化作用,部分依赖于通过RNA聚合酶和不完整核苷酸混合物在体外合成RNA,并对RNA片段进行化学测定。Fiers使用已知蛋白质序列信息来限制可能的密码子,并且组装重叠片段。
Sanger在1975年发明的测序法通过DNA聚合酶使人工合成的短寡聚核苷酸引物延伸,与单链DNA模板杂交,合成新的DNA片段。Sanger测序法的第一个版本使用双阶段DNA合成反应。在第一阶段,测序引物利用4种三磷酸脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的混合物进行部分延伸,生成一批新合成的DNA片段,它们全部以引物为起始,延伸至“随机”长度。在第二阶段,部分延伸的模板被分成4个平行的DNA合成反应,每个反应只包括4种三磷酸脱氧核苷酸中的3种。“合成并尽可能在每条链上持续延伸:因此,如果dATP是未加入的那个三磷酸盐,每条链都会在3′端终止于A残基前的位置”(Sanger and Coulson 1975)。接着,新合成的DNA片段从模板链变性分离,通过丙烯酰胺凝胶电泳在相