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| 內容簡介： |
实验教学是医学教育的重要内容，是培养实践能力和创新精神的创新型人才的重要环节。在积累多年实验教学经验的基础上，结合当今先进的医学免疫学、医学微生物学及人体寄生虫学实验技术，我们编写了这本涵盖这三个学科的实验教材。本教材包括三篇：第一篇为三个学科的基本实验，分属三章；第二篇为融合实验，培养学生的综合、分析能力；第三篇为创新实验，培养学生的独立思考和创新能力。
本实验教材概念准确、文字简明、层次清晰、使用方便；一本教材三个学科使用，便于学生提前预习和教师对相关学科实验内容的了解。
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| 目錄：
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第一篇 基本实验
第一章 医学免疫学
实验一 巨噬细胞吞噬功能实验
实验二 凝集反应
实验三 沉淀反应
实验四 补体结合实验
实验五 免疫标记技术
实验六 外周血及组织中单个核细胞的分离
实验七 E-玫瑰花环形成实验
实验八 豚鼠过敏实验——Ⅰ型超敏反应
第二章 医学微生物学
实验一 细菌的形态和特殊结构观察
实验二 细菌的培养
实验三 细菌菌落计数
实验四 细菌的生理
实验五 物理、化学及生物因素对细菌的影响
实验六 细菌的变异性实验
实验七 细菌的致病性实验
实验八 结核分枝杆菌的培养及形态观察
实验九 细菌质粒DNA的提取
实验十 病毒的观察
实验十一 病毒的培养
实验十二 病毒的血清学实验
实验十三 支原体、衣原体、立克次体、螺旋体的形态观察及血清学实验
实验十四 真菌、放线菌的培养方法与形态观察
实验十五 用PCR方法检测病原微生物
第三章 人体寄生虫学
实验一 总论 线虫1
实验二 线虫2
实验三 线虫3
实验四 吸虫1
实验五 吸虫2
实验六 绦虫
实验七 医学原虫1——溶组织内阿米巴和非致病阿米巴
实验八 医学原虫2
实验九 医学原虫3
实验十 机会致病原虫
实验十一 医学节肢动物1
实验十二 医学节肢动物2
实验十三 医学节肢动物3
第二篇 融合实验
实验一 小儿腹泻的病原体检测
实验二 化脓性球菌的分离鉴定
实验三 病原性真菌的检查法
实验四 流感病毒的分离、鉴定
实验五 TORCH感染的检测
实验六 日本血吸虫家兔模型建立和鉴定
实验七 食用猪肉和淡水鱼的寄生虫学检疫
实验八 孢子虫动物模型的建立
实验九 B淋巴细胞免疫功能的检测
实验十 T淋巴细胞免疫功能检测
实验十一 NK细胞功能检测
实验十二 多克隆抗体的制备与检测
实验十三 伤寒沙门菌感染小鼠后T细胞亚群的检测
实验十四 肿瘤坏死因子的诱生及活性测定
第三篇 创新实验
实验一 运用你所掌握的实验技术检测环境及人体中细菌、真菌的分布及种类
实验二 如何确定一个华支睾吸虫病的流行区
实验三 暴发性腹泻的流行病学调查和控制方案
实验四 “蜱咬性发热伴血小板减少综合征”传播媒介调查和控制方案
实验五 庭院蚊虫的调查和控制方案
实验六 人体蠕形螨感染的检查
实验七 流式细胞术检测Th1淋巴细胞功能
实验八 如何利用实验方法检测T细胞亚群
实验九 如何进行骨髓移植前的HLA配型
实验十 DC的诱生与鉴定
实验十一 巨噬细胞活性测定
实验十二 基因工程疫苗的设计及其免疫效果的实验室评价
实验十三 利用实时荧光定量PCR技术进行病原体诊断与分析
实验十四 基因芯片技术在病原微生物鉴定与研究中的应用
实验十五 病原生物实验室生物安全
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| 內容試閱：
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第一篇 基本实验
第一章 医学免疫学
实验一 巨噬细胞吞噬功能实验
【原理】 巨噬细胞（macrophage，MΦ）作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。MΦ 受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。在此，介绍三种小鼠腹腔MΦ 吞噬功能两种的方法：
1.体内法 在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射白假丝酵母菌，30min 后处死小鼠，取出腹腔液，以冷亚甲蓝染色，油镜下计数吞噬白色念珠菌的百分数，及观察MΦ 内因被杀死而染为蓝色的白假丝酵母菌的形态、数目，以判断MΦ 的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。
2.体外法
（1） 白假丝酵母菌吞噬实验：在体外将小鼠腹腔MΦ 与白假丝酵母菌按比例混合，温育，以冷亚甲蓝染色，油镜下进行观察，观察指标同上。
（2） 荧光微球吞噬实验：在体外可将小鼠腹腔MΦ 与FITC 标记的右旋糖酐按比例混合，温育，流式细胞术检测对FITC-右旋糖酐的吞噬能力。
【材料】
（1） 动物：小白鼠（雌或雄，20 ～22g）。
（2） 无菌6% 淀粉、无菌性注射器、针头、Hank’s 液（含5% 小牛血清液）。
（3） 白假丝酵母菌悬液：接种于沙氏培养基的白假丝酵母菌，28℃培养18 ～ 24h，生理盐水洗涤，配成1×107 个 ml 细胞悬液。
（4） 0.03% 亚甲蓝溶液（4℃存放）、华氏管、吸量管。
（5） FITC-Dextran（FITC-右旋糖酐）为Sigma 公司产品。
（6） 流式细胞仪。
【方法】
1.体内法
（1） 试验前3d，小白鼠腹腔注射6% 无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。
（2） 实验时，每只小鼠腹腔注射白假丝酵母菌菌液1ml，轻揉腹部，使菌液在腹腔中分布均匀，利于吞噬。
（3） 30min 后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用接种环取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03% 冷亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。
（4） 高倍镜下进行观察，计数。
2.体外法――白假丝酵母菌吞噬实验
（1） 将6% 的消毒淀粉液1ml 注入小鼠腹腔。
（2） 72h 后，拉颈处死小鼠，剖腹，吸取腹腔液，1000r min，离心5min，收集MΦ。
（3） 以Hank’s 液洗涤MΦ，1000rpm 离心5min，重复二次。
（4） 计数MΦ，以Hank’s 液配制1×106 个 ml 细胞悬液。
（5） 取华氏管，加入等量的1×106 个 ml 的MΦ 悬液及1×107 ml 白假丝酵母菌菌液。
（6） 37℃，温育30min（中间摇动试管二次）。
（7） 500r min 离心5min，弃上清液。
（8） 轻轻振荡试管，取悬液一滴加至载玻片，取冷亚甲蓝一滴，混匀后，加盖玻片。
（9） 高倍镜观察并计数。
3.体外法――荧光微球吞噬实验
（1） 同上获取小鼠腹腔巨噬细胞，计数，调整细胞密度至5×106 ml。
（2） 取100μl，加入FITC-Dextran（终浓度为500μg mL），同时设置不加FITC-Dextran 的PBS 空白对照孔和加FITC-Dextran 的4℃对照。
（3） 轻轻混匀，将其分别置于37℃、5% CO2 培养箱和4℃ 冰箱中静置90min（每隔15min 摇动试管一次）。
（4） 在各样品中分别加入PBS 4ml，吹打混匀，1000r min 离心5min，弃上清；重复该操作3 次。
（5） 过滤上流式细胞仪检测，每个样本检测1 万～2 万个细胞。
（6） 由单参数直方图可直接获得吞噬百分率，以平均荧光强度代表单个巨噬细胞的吞噬强度。
【结果】
1.计算方法
（1） 吞噬百分率=100 个MΦ 内发生吞噬的MΦ 数100 ×100%
（2） 吞噬指数=发生吞噬的100 个MΦ 内含有的白假丝酵母菌数100（发生吞噬的MΦ 数） ×100%
（3） 杀菌率=被吞入的白假丝酵母菌中死亡数被吞入的白假丝酵母菌菌数×100%
（杀死的细菌呈蓝色，活菌不着色）
2.正常值
（1） 吞噬百分率：62.77±1.38。
（2） 吞噬指数：1.058±0.049。
（3） 杀菌率：因激活条件、观察计数时间的不同而表现不同（计算杀菌率应减去白假丝酵母菌的自然死亡率）。
【注意事项】
（1） 吞噬用的白假丝酵母菌菌龄应在18 ～24h 内，不能有假菌丝及出芽现象。
（2） MΦ 数与白假丝酵母菌数要计数准确，温育时其比例为MΦ ∶ 白假丝酵母菌=1 ∶ 10。
（3） 温育时要摇动2 ～3 次，以免MΦ 与白色念珠菌沉于管底。
（4） MΦ 要计数准确，注意加入适量FITC-Dextran（终浓度为500μg ml），并设立空白与4℃对照。
实验二 凝集反应
抗原与相应抗体相遇，可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀。此原理可用已知抗原（或抗体）检测未知抗体（或抗原）。实验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应。
一、直接凝集反应
直接凝集反应是指颗粒性抗原（如完整的细菌或细胞）与相应抗体在体外直接结合而出现的凝集反应。
直接凝集反应又可分为：玻片凝集和试管凝集。
（一） 玻片凝集实验（人ABO 血型鉴定）
玻片凝集试验是用已知抗体与未知颗粒性抗原在玻片上直接结合而出现的凝集反应。
这类反应较简单、迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。例如，细菌的鉴定、分型及ABO 血型鉴定。这里介绍人类的ABO 血型鉴定方法。
【原理】 ABO 血型系统是按照血液中红细胞表面的抗原分子来命名的。人类ABO 血型抗原有两种：A 抗原和B 抗原。A 型血红细胞表面有A 抗原，B 型血红细胞表面有B 抗原，AB 型血红细胞表面有A、B 两种抗原，若红细胞表面无这两种抗原，则为O 型血。
若用已知的抗A 血清和抗B 血清与受试者红细胞上的相应抗原结合，即可能引起红细胞凝集，据凝集状况便可判定出受试者的血型。
【材料】
（1） 标准抗A 血清、抗B 血清。
（2） 玻片、乙醇溶液、碘酒、无菌三棱采血针、无菌木棒、无菌棉棒。
【方法】
（1） 取洁净载玻片1 张，用蜡笔分为2 格，注明A、B 字样。
（2） 倒置标准抗血清试剂瓶，悬空轻挤出抗A 血清1 滴，滴加在A 格内；同法在B 格内加抗B 血清1 滴。
（3） 消毒左手环指指尖，待乙醇自然干燥后，用无菌采血针快速刺破皮肤。
（4） 用木棒的两端取血，分别在抗A 血清和抗B 血清中搅拌混匀。
（5） 无菌干棉球压迫手指止血。
（6） 静置玻片数分钟，在白色背景下观察凝集结果。
【结果】 混合液由红色均匀浑浊逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，为红细胞凝集。混合液仍呈均匀浑浊， 则未发生凝集。根据结果可判断血型，表1-1-1。
【注意事项】
（1） 载玻片标明A、B，不要让两种抗血清混合。
（2） 采血前要消毒手指，在乙醇干燥前不要采血，以免乙醇破坏红细胞。
（3） 木棒的两端不可混用。
（4） 及时观察结果。
（5） 对被血液污染的用品在废弃前，要定点放置，集中进行严格的消毒，以防传播疾病。例如，沾血的载玻片浸泡在84 消毒液中，木棒、采血针、棉球要高压处理。
（二） 试管凝集实验
【原理】 此次实验是以定量的伤寒菌为抗原，根据是否发生凝集反应，来检测血清中是否含有对应的抗体；并根据各管凝集程度的不同，来判断抗体的效价。应用此原理可帮助临床诊断和判断患者的病程、预后等。
【材料】
（1） 灭活的伤寒菌液（7×108 ml）。
（2） 待检的动物血清（经伤寒“H”免疫）。
【方法】
（1） 取试管6 支，用红笔标记好顺序，依次放在试管架中。
（2） 于第1 管内加生理盐水0.9ml，其余各管加生理盐水0.5ml。然后在第一管中加入伤寒免疫血清0.1ml，用吸管将它与生理盐水吹打混匀后，取出0.5ml 加入第二管中；再将第二管中的液体吹打混匀，取出0.5ml 加入到第三管中，其余各管都照此方法将血清对倍稀释。至第5 管时，将试剂混匀后，取出的0.5ml 弃去不用。使第6 管不含伤寒免疫血清，作为实验的阴性对照管。最后在各管中都加入0.5ml 伤寒菌液。加样量如表1-1-2 所示。
轻摇试管架，混匀试管内液体，56℃水浴1 ～2h，观察结果。
【结果】
1.对照管 即（第6 管），上清液浑浊，管底可有沉淀的细菌，轻摇后分散呈均匀浑浊。
2.实验管 按1 ～5 管依次观察。阳性者管底有不规则凝集物，较松散。阴性者与对照管相同。
3.凝集程度的判断
++++：液体澄清透明，细菌全部凝集于管底，轻摇可见大的凝集块。
+++：液体稍浑，细菌大多数凝集于管底，摇动后凝块较前者小。
++：液体中等浑浊，液体中有明显的凝集物，凝集块较小。
+：液体浑浊，仔细观察可以看到液体中有很小的凝集颗粒。
-：与对照管相同。
4.判断凝集效价 出现明显可见凝集物（++）时的血清最高稀释度为血清效价。
【注意事项】
（1） 试管要做标记，不同试剂的吸管勿交叉混用。
（2） 在对倍稀释伤寒免疫血清时，要混匀后再加入下一试管。
（3） 加样要准确，避免有气泡干扰。
（4） 加样后要轻摇混匀，再进行水浴。
（5） 水浴时避免水滴落入试管内，影响结果。
（6） 实验结束时，小心轻取出试管，以免凝集物分散，影响观察。
（7） 先观察对照管的结果，判断实验可信性；然后观察实验管。
二、间接凝集反应
颗粒性抗原与相应抗体的反应可用直接凝集来定性、定量。而可溶性抗原与相应抗体的反应不能发生肉眼可见的直接凝集现象。借鉴直接凝集反应的原理，把可溶性抗原附加在颗粒性物质――载体上，使之成为人工的颗粒性抗原，然后与相应的抗体混合，观察间接凝集现象。
间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在与免疫无关、有一定大小的颗粒性物质（载体）上，然后再与相应抗体（或抗原）反应而出现的凝集反应。常用作载体的物质有红细胞、聚苯乙烯胶乳颗粒、金黄色葡萄球菌A 蛋白（SPA）等。根据载体的不同，间接凝集反应可分为血凝抑制试验、胶乳凝集试验、协同凝集试验等。
本文只介绍用于诊断妊娠的胶乳凝集试验。
【原理】 以聚苯乙烯胶乳颗粒作为载体，抗原致敏的胶乳颗粒与相应抗体结合能发生凝集。如果先将抗体与可溶性抗原作用，然后加入抗原致敏的胶乳颗粒，则不出现凝集，称为胶乳凝集抑制试验。
妊娠妇女尿液中含有人绒毛膜促性腺激素（the human chorionic gonadotropin，HCG），将待测尿液与抗HCG 的血清混合，该尿液中的HCG 与抗血清结合，消耗了抗HCG 血清。然后加入HCG 致敏的胶乳颗粒，无抗HCG 血清与之反应，不能发生凝集，为妊娠试验阳性。如果待测尿液中没有HCG，则致敏胶乳颗粒与抗HCG 血清结合，发生凝集，称为妊娠试验阴性。
【 材料】
（1） HCG 致敏的胶乳抗原。
（2） 抗HCG 的血清。
（3） 妊娠妇女尿液与未妊娠妇女尿液。
（4） 妊娠试验板，滴管。
【方法】
（1） 在试验板的相邻两孔中分别加入1 滴妊娠妇女尿液和未妊娠妇女尿液。
（2） 在上述两孔中分别悬空加入1 滴抗HCG 的血清，轻摇混匀1 ～3min。
（3） 在上述两孔中分别悬空加入1 滴致敏胶乳抗原，轻摇混匀1 ～3 分钟，观察结果。
【结果】 出现白色细小凝集颗粒者为妊娠实验阴性；不出现凝集者呈白色混浊液，为妊娠试验阳性。
【注意事项】
（1） 标本和试剂应按顺序加入。
（2） 滴加抗HCG 血清和胶乳抗原时应悬空加入，以免污染试剂。
（3） 加入试剂时液滴大小应均匀。
实验三 沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合，在一定条件下出现沉淀线 环的现象，称为沉淀反应。常用的沉淀反应有环状沉淀反应、絮状沉淀反应、琼脂扩散及免疫电泳等。
琼脂扩散试验是指可溶性抗原与抗体在琼脂内扩散，若两者对应且比例适当，则出现白色沉淀线 环。琼脂是大分子多糖，100℃时熔化，45℃以下凝固而形成网状结构，允许抗原抗体分子在其中自由扩散。琼脂扩散试验又可分为单向和双向扩散，只有抗原或抗体扩散的试验称为单向扩散，可用于定量检测；抗原与抗体都发生扩散的试验称为双向扩散，常用于定性检测。
一、单向琼脂扩散实验
【原理】 单向琼脂扩散实验是定量实验，通常是用已知抗体测定未知抗原。实验中将定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，制成含抗体的琼脂板，凝固后打孔。再将待检抗原加入孔内。因抗体与琼脂混合凝固，抗体的浓度均匀，只有孔中抗原向四周扩散，离孔愈远浓度愈低，这样在抗原、抗体比例合适处形成白色沉淀环。由于只有抗原扩散，故称之为单向扩散。
观察结果可发现，在同样的反应条件下，沉淀环的直径大小与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应形成的沉淀环的直径为纵坐标，以抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。量取待测抗原出现的沉淀环直径，从标准曲线中即可求得其含量。
本试验可用于检测标本中各种免疫球蛋白或血清补体含量。
【材料】
（1） 人免疫球蛋白IgG 的诊断血清（冻干羊抗人IgG）。
（2） 人免疫球蛋白标准血清，待检人血清。
（3） 琼脂、玻片、打孔器、加样器、湿盒、37℃恒温箱等。
【方法与结果】
1.制板 按抗血清效价的一半，用56℃预热的生理盐水稀释抗血清，再加入等量的冷却至56℃的琼脂轻轻混匀。在微波炉里加热至熔化后，用5ml 吸管吸取3ml 含抗血清的琼脂均匀加到玻片上，凝固后放4℃冰箱5min。
2.打孔 以打孔器打孔，孔径3mm，孔距1cm，每板2 排，每排5 个孔。
3.稀释 按说明书要求稀释标准血清与待检血清。待检血清1 ∶ 50 稀释，标准血清系列稀释至1 ∶ 12.5、1 ∶ 25、1 ∶ 50、1 ∶ 100、1 ∶ 200。
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