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| 內容簡介： |
本书介绍了常用的分子生物学和基因工程实验技术。全书分为三部分，第一部分为基础性实验，介绍了一些简明且独立的实验方案，每个实验可在半日内完成，且成功率高，因此特别适用于相关专业的本科实验教学；第二部分为综合性实验，实验略微复杂，适用于有一定基础的高年级本科生实验教学；最后一部分为研究性实验，为培养学生独立科研的能力提供了更加贴近科研工作的实验方案。
本书介绍的实验方法严谨可靠，可操作性强，实验结果明显。不仅可以作为高等师范院校生命科学专业的本、专科学生的实验教程，也可供非师范院校相关专业的学生和生命科学工作者参考。
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| 目錄：
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再版说明
第二版前言
第一部分 基础性实验
实验1 质粒的分离——碱性SDS法
实验2 Silica硅石粉法纯化质粒
实验3 吸附膜方法提取质粒DNA
实验4 核酸琼脂糖凝胶电泳及“玻璃奶”法纯化回收DNA片段
实验5 吸附膜方法回收琼脂糖凝胶中DNA片段
实验6 DNA片段的连接向质粒载体中插入外源DNA
实验7 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子的鉴定蓝白斑筛选法
实验8 聚合酶链式反应PCR技术
实验9 PCR产物连入T载体
实验10 菌落PCR方法快速筛选细菌重组子
实验11 重组子的插入方向鉴定酶切法
实验12 噬菌体铺板
实验13 M13噬菌体DNA的提取
实验14 SDS法小量提取植物基因组DNA
实验15 CTAB法小量提取植物基因组DNA
实验16 动物组织细胞基因组DNA提取
实验17 血液基因组DNA的纯化分离
实验18 Trizol试剂快速提取动植物总RNA
实验19 总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳检测
实验20 植物启动子表达分析——β-葡萄糖醛酸糖苷酶GUS组织化学染色
第二部分 综合性实验
实验21 反转录PCR
实验22 谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白质的表达及纯化
实验23 His6标记蛋白质的原核表达和纯化
实验24 Western-blotting分析
实验25 化学发光Western-blotting分析
第三部分 研究性实验
实验26 地高辛标记探针的Southern杂交
实验27 菌落原位杂交
实验28 转基因植物的PCR检测
实验29 花序浸泡法转化拟南芥及转化子的筛选
实验30 叶盘法转化烟草
实验31 PCR引物的电子设计
参考文献
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| 內容試閱：
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第一部分 基础性实验
实验1 质粒的分离――碱性SDS 法
【实验目的】
1.学习碱法分离质粒的基本原理。
2.掌握碱法分离质粒的操作方法。
【实验原理】
质粒是染色体之外裸露的、具有自主复制能力的、以超螺旋状态存在于细胞内的双链DNA 分子。质粒的分离是分子生物学研究中最基本的技术，目前提取质粒的方法很多，比如CsCl 梯度离心法、煮沸法、硅石粉法、碱性SDS 法等。本实验所用的碱性SDS 法（简称碱法）是一种经典的分离质粒DNA 的方法，其基本原理是利用染色体DNA 与质粒DNA 在变性程度和复性速度的差异，即在pH ＞ 12 的碱性条件下，大肠杆菌的线性染色体由于氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，但在该条件下，质粒由于其共价闭合环状超螺旋结构的特点，两条互补链间的氢键没有完全被破坏，两条链仍然部分地结合在一起，当将溶液的pH 调至中性时，质粒DNA 会快速复性，但是染色体DNA 由于分子很大，难以复性，在高盐溶液中，变性的染色体DNA 相互缠绕，形成不溶性DNA 蛋白质SDS 大分子复合体，与细胞碎片一起被离心除去，而质粒DNA 存留在上清液中，可用异丙醇或乙醇沉淀上清溶液中的质粒DNA，获得纯度较高的质粒。
【实验器材、材料与试剂】
1.器材
恒温摇床、超净工作台、高压灭菌锅、高速台式离心机、微量移液枪、枪头、1.5 ml Eppendorf 管。
2.材料
含pUC18 质粒的大肠杆菌DH5α 或JM109 菌株。
3.试剂
（1） LB 液体培养基
称取胰蛋白质胨10 g 、酵母提取物5 g 、NaCl 10 g 溶于950 ml 水中，用0.4 molLNaOH 调节pH 值至7.0，定容至1 L，高温高压灭菌。
（2） LB 固体培养基
称取琼脂粉15 g，加入1 L LB 液体培养基中，高温高压灭菌。
（3） 溶液Ⅰ
含50 mmolL 葡萄糖、25 mmolL Tris Cl （pH 8.0） 、10 mmolL EDTA（pH 8.0），高温高压灭菌后，4 ℃ 保存备用。
（4） 溶液Ⅱ
（新鲜配制）含0.2 molL NaOH 、1 % （ m V）SDS 。
由新配制的0.4 molL 的NaOH 和2 % 的SDS 等体积混合而成。溶液Ⅱ 中如有絮状沉淀，可置于温水浴中助溶，如果溶液不变澄清，说明试剂失效。
（5） 溶液Ⅲ
取5 molL 醋酸钾60 ml 、冰醋酸11.5 ml 和无菌水28.5 ml，混合既成。
（6） 氨苄青霉素（Amp）
用无菌蒸馏水配制100 mgml 氨苄青霉素贮存液，置- 20 ℃ 冰箱保存备用。
（7） RNaseA 溶液
用含10 mmolL Tris Cl（pH 7.5）和15 mmolL NaCl 溶液或无菌水配制10 mgml 的RNaseA 溶液。配成的RNaseA 溶液在沸水浴中加热15 min，自然冷却至室温，分装成小份，- 20 ℃ 保存。
（8） TE RNaseA 缓冲液
含10 mmolL Tris Cl（pH 8.0）和1 mmolL EDTA（pH 8.0） 。TE 缓冲液配好后灭菌15 min，冷却至室温后加入RNaseA 溶液，至终浓度为20 μgml 即为TE RNaseA 缓冲液。
（9） 氯仿异戊醇
含V（氯仿） ∶ V（异戊醇）为24 ∶ 1，混匀使用。
（10） 酚氯仿
Tris Cl 饱和酚加入等体积氯仿异戊醇，混匀使用。
（11） 70 % （ V V）乙醇
（12） - 20 ℃ 预冷的异丙醇或无水乙醇
【操作步骤】
1.在超净工作台上，用灭菌的牙签挑取单菌落放入50 ml LB 液体培养基中（含50～100 μgml 的Amp），37 ℃ 振荡培养过夜。
2.将1.5 ml 菌液倒入1.5 ml Eppendorf 管中，以10 000 rmin 的转速离心1 min，弃去上清液，将Eppendorf 管倒置于吸水纸上数分钟，使液体流尽。
3.沉淀悬于100 μl 溶液Ⅰ 中，涡旋或剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入200 μl 溶液Ⅱ，轻轻翻转Eppendorf 管5～7 次混匀溶液（不要振荡涡旋），置冰浴5 min 。
5.加入150 μl 溶液Ⅲ，温和振荡混匀，冰浴3～5 min 。
6.以12 000 rmin 的转速离心10 min，将上清液移至新的Eppendorf 管中。
7.加入等体积酚氯仿，涡旋2 min，以12 000 rmin 的转速离心10 min 。
8.将水相移至新Eppendorf 管中，加入预冷的等体积异丙醇或2～2.5 倍体积的无水乙醇，- 20 ℃ 下静置30 min，以12 000 rmin 的转速，在4 ℃ 下，离心10 ~15 min 。
9.弃去上清液，将Eppendorf 管倒置于吸水纸上，使液体流尽，然后加入70 %（ V V） 乙醇500 μl，洗涤2 次，以12 000 rmin 的转速离心1 min 。
10.弃去上清液，将Eppendorf 管倒置于吸水纸上，使液体流尽，然后在50 ℃下，干燥15 min 或自然风干。
11.每管中加入30 μl TE RNaseA 缓冲液，溶解质粒DNA，- 20 ℃ 储存。
【要点提示】
1.加入溶液Ⅱ 后混匀时动作一定要轻，冰浴时间不要超过5 min 。
2.实验中所用的酚必须是Tris Cl 饱和酚（pH 8.0）（有市售），如果饱和酚呈粉红色，则说明试剂失效，不能继续使用。
3.溶液Ⅱ 中的NaOH 要现配现用。
【思考题】
1. NaOH 在质粒分离中的主要作用是什么？
2.加入溶液Ⅱ 后混匀时为什么动作一定要轻，同时冰浴时间不要过长？
3.有人认为菌体细胞的裂解主要是SDS 的作用，你同意此看法吗，为什么？
4.试分析一下碱法能不能用来提取染色体DNA，为什么？
实验2 Silica 硅石粉法纯化质粒
【实验目的】
1.了解硅石粉法提取质粒的原理。
2.掌握硅石粉法提取质粒的步骤。
【实验原理】
silica 硅石粉在一定的条件下可以选择性的吸附DNA 。在水溶液中DNA 分子带负电荷，而silica 表面的硅氧键水化后带负电荷，DNA 分子和硅胶之间产生静电排斥，silica 硅石粉不能结合DNA，当溶液中含有高浓度的阳离子时，阳离子在DNA 与silica 硅石粉表面形成阳离子桥，DNA 吸附在silica 硅石粉表面（但silica不结合蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物），当溶液离子浓度再次降低时，水分子破坏了阳离子桥，silica 硅石粉表面再次水化带负电荷，DNA 从silica 硅石粉表面解吸，释放到溶液中（图1 1） 。
利用silica 硅石粉纯化质粒DNA 时，首先是利用了碱法提取质粒DNA，再在高盐条件下利用silica 硅石粉特异性地吸附质粒DNA，并用70 % 乙醇溶液洗去不被silica硅石粉吸附的杂质（包括蛋白质和多糖等物质），最后利用纯水处理silica 硅石粉，解吸silica 硅石粉上吸附的质粒DNA，获得高纯度的质粒。用silica 方法纯化DNA，无需酚抽提，DNA 回收率高，纯度满足DNA 酶切、测序、连接、转化和体外转录等分子操作。
【器材与试剂】
1.实验器材
参见实验1 。
2.材料与试剂
（1） silica 硅石粉悬液
称取5 g silica 硅石粉（Sigma 产品，货号S 5631），加20 ml H2 O，使silica 硅石粉完全悬浮，然后静置2 h，轻轻地倾去混浊的悬液（保留沉淀），重复清洗沉淀3次，用20 ml H2 O 使silica 硅石粉悬浮，4 ℃ 保存备用。
（2） 溶液Ⅰ
含50 mmolL Tris Cl，10 mmolL EDTA（pH 7.5～8.0） 和10 mgmlRNaseA 。
（3） 溶液Ⅱ
含0.2 molL NaOH，1 % （ m V）SDS 。
（4） 溶液Ⅲ
4 molL KAc（pH 4.8） 。
（5） 6 molL 盐酸胍
（6） 70 % （ V V）乙醇
【操作步骤】
1.取1.5 ml 过夜培养的菌液于1.5 ml Eppendorf 管中，以5 000 rmin 的转速离心1 min，弃去上清液。
2.加入200 μl 溶液Ⅰ，涡旋，使细胞沉淀充分悬起。
3.加入200 μl 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀，放置5 min 。
4.加入200 μl 溶液Ⅲ，轻轻混匀，以12 000 rmin 的转速离心10 min 。
5.取上清液至新的1.5 ml Eppendorf 管中，加入6 molL 盐酸胍600 μl，混匀后，再加入50 μl silica 硅石粉混匀。
6.以12 000 rmin 的转速离心3 min，弃去上清液。
7.加入70 % （ V V） 乙醇1 ml，充分悬起silica 硅石粉，以12 000 rmin 的转速离心3 min，弃去上清液。
8.重复操作步骤7 。
9.干燥沉淀10 min 。
10.加入50 μl 无菌水，65 ℃ 水浴5 min 。
11.室温下，以12 000 rmin 的转速离心5 min 。
12.取上清液至新的Eppendorf 管中，- 20 ℃ 储存。
【要点提示】
1.加入溶液Ⅱ 、Ⅲ 后，轻轻颠倒混匀，防止基因组DNA 断裂，此过程与碱法提取质粒DNA 一致。
2.在步骤9 中，尽量吹干酒精，酒精会影响下游操作。
3. 65 ℃ 水浴有利于质粒充分从silica 硅石粉上解吸，提高质粒DNA 的回收率。
【思考题】
1.实验中，盐酸胍的作用是什么？
2.水浴的作用是什么？ 可否用沸水浴解吸质粒？
3.本实验中，样品中的RNA 是如何除去的？
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