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| 內容簡介： |
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本书涵盖了成体和胚胎干细胞的整体概念、基础生物学机制、研究工具、研究方法和实验方案、针对特定人类疾病的干细胞的应用等问题。本书适合从事细胞生物学学习和研究的研究生、临床医务人员和科研人员，以及对干细胞有兴趣的生命科学领域的科研人员参考。
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| 目錄：
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第一部分 器官来源的干细胞
第1章 神经干细胞的分离和特征描述
1.引言
2.试剂和仪器
3.方法
参考文献
第2章 神经干细胞及其操作
1.引言
2.成体干细胞的体内小生境
3.神经干细胞的体外操作
4.结论和预测
5.神经干细胞培养规程和生物学特性
6.啮齿类鼠科动物神经干细胞培养
7.人神经干细胞培养
8.ICC标志定义干细胞和分化产物
参考文献
第3章 视网膜干细胞
1.引言
2.材料和方法
3.总结
参考文献
第4章 牙髓干细胞
1.引言
2.牙髓干细胞的鉴定
3.牙髓干细胞的分离
4.牙髓干细胞的分化
参考文献
第5章 小鼠精原干细胞的培养和移植
1.引言
2.精原干细胞SSC
3.SSC移植
4.SSC培养
5.用siRNA转染培养的小鼠SSC
6.结果
参考文献
第6章 成体肺中的干细胞
1.引言
2.成体肺的解剖学和细胞多样性
3.成体肺的干细胞表型和小生境
4.体内肺损伤模型
5.用气管上皮移植片回植模型研究干细胞在近端气道内的增殖
6.利用体外克隆形成率对导气部上皮的干祖细胞进行特征描述
7.气道SMG干祖细胞的研究模型
参考文献
第7章 胰腺细胞及其祖细胞
1.引言
2.胰腺发育
3.出生后的β细胞起源
4.已经存在的β细胞
5.导管
6.腺泡
7.骨髓细胞
8.成体干细胞
9.β细胞分化
10.总结和展望
11.方法学:小鼠谱系追踪实验的设计
参考文献
第8章 来自生殖细胞的亚全能干细胞:衍化生成和维持培养
1.引言
2.生殖细胞的发育
3.EGC的衍化生成
4.EG培养物的特征描述
5.EB 形成和分析
6.EB 源细胞形成
参考文献
第9章 来自羊水和胎盘的亚全能干细胞
1.引言
2.发育生物学中的羊水和胎盘
3.一种新思路:将羊水和胎盘细胞用于治疗
4.祖细胞的分离和特征描述
5.羊水和胎盘源祖细胞的分化
6.结论
参考文献
第10章 脐带血中的造血干细胞和祖细胞
1.引言:脐带血移植
2.人类脐带血中造血祖细胞和干细胞以及EPC的评估方法
3.上述方法的应用
参考文献
第11章 骨髓造血干细胞:纯化与功能分析
1.引言
2.其他的HSC表面标志物:Tie-2、Endoglin和SLAM家族受体
3.HSC与SPKLS的荧光染料外向通量
4.不同纯化方法所得HSC的特性
5.通过Hoechst
33342染色分选HSC的方法SP群
参考文献
第12章 干细胞及其分化的微阵列分析
1.引言
2.微阵列技术简介
3.实验设计
4.结果验证
5.干细胞及其分化微阵列的应用实例
6.鉴定“干性”
7.分化
8.干细胞小生境
9.未来研究的方向
参考文献
第13章 利用成体干细胞的组织工程学
1.引言
2.生物材料
3.血管生成因子
4.用于组织工程的成体干细胞
5.结论
参考文献
第14章 利用间充质干细胞的组织工程学
1.MSC的定义和治疗潜力
2.MSC的分离和扩增
3.MSC的多谱系分化
4.基于MSC的临床移植疗法
5.结论
参考文献
第二部分 胚胎干细胞及其衍生物
第15章 小鼠胚胎干细胞
1.历史回顾
2.影响小鼠ES细胞建系效率的因素
3.影响小鼠ES细胞参与形成嵌合胚胎的因素
4.小鼠ES细胞建系期间的关键事件
5.ES细胞系的冻存
6.特征描述
7.操作规程
参考文献
第16章 人类胚胎培养物
1.引言
2.人类胚胎发育
3.胚胎活组织检查
4.人类胚胎培养物
5.结果
参考文献
第17章 人类胚胎干细胞:衍化生成和维持培养
1.引言
2.hES细胞系的衍化生成
3.hES细胞的维持培养
4.结论
参考文献
第18章 人类胚胎干细胞:特征描述和评估
1.引言
2.未分化hESC的特征描述
3.结论
参考文献
第19章 人类胚胎干细胞:无饲养层培养
1.引言
2.hESC无饲养层培养法
参考文献
第20章 来自胚胎干细胞的神经干细胞、神经元和神经胶质细胞
1.引言
2.操作方法
3.小结
4.培养基和添加剂
参考文献
第21章 从胚胎干细胞到造血细胞的分化
1.引言
2.方法
参考文献
第22章 从胚胎干细胞到心肌细胞的分化
1.引言
2.拟胚体形成
3.心肌细胞分化
4.心肌细胞富集
5.结论
参考文献
第23章 从小鼠胚胎干细胞到胰岛素-生成细胞的分化
1.引言
2.材料和方法
3.结果
4.小结
参考文献
第24章 胚胎干细胞中的转基因表达和RNA干扰
1.逆转录病毒表达载体和ESC
2.RNA干扰和ESC
3.siRNA表达载体设计
4.逆转录病毒生产
5.逆转录病毒和慢病毒基因转移到小鼠和人ESC中
6.小鼠和人ESC中的转基因表达和siRNA表达
7.生物技术应用与医学应用
参考文献
第25章 人类胚胎干细胞中慢病毒载体介导的基因递送
1.引言
2.设计基于HIV-1的载体用于转导hESC
3.重组病毒颗粒的产生
4.hESC的转导
5.转导效率的测量
6.表达高水平转基因的转导hESC的富集
7.病毒滴度的确定
参考文献
第26章 用重组酶系统改造胚胎干细胞
1.引言
2.位点特异性重组
3.设计用于位点特异性重组的底物
4.产生条件性基因突变
5.重组酶介导的盒式交换
6.分子开关
7.实验方法
参考文献
第27章 利用胚胎干细胞的组织工程学
1.引言
2.以hESC作为用于组织工程的细胞来源时的特别考虑
3.特定无动物条件下培养hESC
4.获得所需的细胞群体
5.选择合适的支架
6.放大一个可调控的生物过程
7.hESC来源的结缔组织前体在组织工程的应用
8.hESC在MEF饲养层上的维持培养
9.收集样品分析
参考文献
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| 內容試閱：
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第一部分 器官来源的干细胞
第1章 神经干细胞的分离和特征描述
RodneyL.RietzeandBrentA.Reynolds
QueenslandBrainInstitute
UniversityofQueensland
Brisbane4072，Australia
摘要
1.引言
2.试剂和仪器
2.1 分离器械
2.2 组织培养器械
2.3 生长因子
2.4 培养基
3.方法
3.1 胚胎神经球的原代培养
3.2 原代成体神经球的培养
3.3 神经球传代
3.4 神经球分化培养
3.5 流式分选富集成体神经干细胞
参考文献
摘要
从胚胎发育开始到成年的整个过程中，干细胞作为各种未分化细胞的储备库，支持各种组织和器官的细胞生成。在成体中，它们替换那些由于生理过程或损伤和疾病而导致损失的分化细胞，从而在维持组织器官的稳态中发挥重要作用。正如上面所说，在成体哺乳动物中枢神经系统（central
nervous
system，CNS）中发现神经干细胞的存在确实是非常出乎意料的，因为传统观念认为这个器官几乎没有再生能力。然而，Reynolds和Weiss应用一个新的无血清的悬浮神经球培养体系，揭示了在胚胎（Reynolds
and Weiss，1996）和成体（Reynolds and
Weiss，1992）小鼠脑中存在神经干细胞。本章将描述幼年和成体来源的神经球的产生、系列传代和分化实验，并提供详细的技术资料，从而使专业人员经过一段时间训练即可进行传代培养。
1.引言
尽管最初关于神经发生（neurogenesis）存在争议，但是现在已经明确了在成体哺乳动物的至少两个区域神经发生仍然是存在的，即嗅球（olfactory
bulb）和海马结构（hippocampal
formation）（Gross，2000）。这两个结构不断产生新的支持细胞，具有增殖（proliferation）、自我复制（self-renewal）和最终产生大量分化的子代细胞（progeny）的能力，被称为干细胞（stem
cell）（Potten and
Loeffler，1990）。鉴定和研究干细胞的困难之一就是它难以定义的物理性质，影响直接检测其存在和活性的能力。然而，基于功能标准来定义干细胞基本解决了这个问题，因此干细胞通常是根据功能而不是形态来定义的，并且在概念上和实践中引发了一系列问题，最明显的问题是我们必须首先诱导干细胞发挥功能从而确定其存在。然而，通过诱导使干细胞具有某些特定的功能是否能准确地反映干细胞的原始和自然本性仍存在质疑。很明显，选择特异的阳性标志物，使我们在体内、体外明确鉴定干细胞是必要的。在这篇综述中，我们将讨论和详细综述哺乳动物脑组织来源的干细胞的培养方法，包括细胞分离、扩增和鉴定，并提供关于应用流式细胞仪从细胞中分离相对高纯度的干细胞群体的实用建议。
以往的大量研究未能揭示神经干细胞（neural stem
cell，NSC）的存在，但却阐明了适合干细胞发挥功能的最佳培养条件。1992年第一次明确地揭示了神经干细胞的存在。为了分离和扩增成体脑来源的干细胞，Reynolds和Weiss采用了无血清培养系统（serum-free
culturesystem），称为神经球分析（neurosphere
assay，NSA），绝大多数神经干细胞分化的细胞在此培养条件下是不能生存的。在这个培养体系中，脑室周围区域大多数细胞类型在培养的前3天中会死亡，只允许不足0.1%的表皮生长因子（epidermal
growth factor，EGF）反应性干细胞进入一个活跃的细胞增殖期（Reynolds and
Weiss，1992）。通过应用这个细胞培养体系，Reynolds和Weiss揭示了单个成体神经干细胞能够增殖形成一个未分化的细胞球，即神经球（neurosphere）：①可以分离形成更多的二代神经球；②也可以进行诱导分化产生中枢神经系统的三大细胞谱系。通过这种方法揭示了分离的细胞具有干细胞的属性，即增殖、自我复制和产生分化的功能性子代细胞的能力（Hall
and Watt，1989；Potten and
Loeffler，1990）。随后的研究表明，使用EGF或者碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth
factor，bFGF）作为丝裂原，或者两种都用，可以产生持续可更新的未分化中枢神经系统前体群体（CNS
precursor）（干细胞的一部分），以神经球方式扩增，也可以分化为神经元（neuron）、星形细胞（astrocyte）和少突细胞（oligodendrocyte）（Gritti
et al.，1995，1996，1999；Reynolds and Weiss，1996；Reynolds et
al.，1992；Weiss，1996a，1996b）。
到目前为止有1000多篇文章引用了神经球分析，证明了这一方法的有效性和可靠性，并且在发育研究方面阐明遗传和表观遗传因子决定神经系统干细胞的潜能和表型具有重要的价值。尽管这一方法似乎容易操作，但是只有严格按照文中所描述的步骤才能获得可靠和稳定的结果。在此，我们将会为大家详细讲述胚胎和成体来源的小鼠各脑区的神经干细胞的分离及培养方案。这些方案需要小鼠脑解剖的基础知识。培养小鼠神经干细胞的方法主要根据O''Connor等1998年的一篇相关文献。
2.试剂和仪器
2.1 分离器械
大剪刀
小剪刀
精细微型剪刀（Fine Science Tools，货号15396-01）
小镊子（Fine Science Tools，货号11050-10）
精细小镊子（Fine Science Tools，货号11272-30）
超精细弯镊子（Fine Science Tools，货号11251-35）
灭菌器（Fine Science Tools，货号250）
分离显微镜
2.2 组织培养器械
培养瓶：25cm
（Reynolds et al.，1992）0.2μm通气过滤帽（TPP，货号9026）
75cm（Reynolds et al.，1992）0.2μm通气过滤帽（TPP，货号90076）
175cm（Reynolds et al.，1992）0.2μm通气过滤帽（TPP，货号90151）
离心管：17mm×100mm聚苯乙烯，无菌（TPP，货号91015）
50ml聚苯乙烯，无菌（TPP，货号91050）
流式分析管（FACS tube），无菌（Falcon，货号352054）
培养皿：100mm、35mm（Nunc，货号351029、174926）
组织筛：70μm（Falcon，货号352350）
细胞培养板：6孔、24孔、96孔（Falcon，货号353046、353047、353072）
8孔铺底载片：多聚赖氨酸层连蛋白（poly-d-lysinelaminin）（BioCoatBD，货号354688）
8孔铺底载片：人纤连蛋白（human fibronectin）（Bio Coat BD，货号354631）
2.3 生长因子
·表皮生长因子（EGF）：人重组的（Stem Cell
Technologies，货号02633）。制备10μgml的储存液，将10ml添加激素的神经培养基加入每支装有表皮生长因子的安瓿瓶中。分装为每支100μl，储存在-20℃。
·成纤维细胞生长因子2（FGF2）：人重组的（Stem Cell
Technologies，货号02634）。储存液为10μgml，将999μl添加激素的神经瓿养基，1μlBSA加入每个装有bFGF的安瓿瓶中。分装为每支100μl，储存在-20℃。
·0.2%肝素（heparin）：将100mg肝素（Sigma，货号H-3149）加入到50ml水中，过滤除菌。储存在4℃下。
2.4培养基
这些培养基对存在于水中或玻璃仪器中的污染物是非常敏感的。如果是实验室自制的培养基，只能是用组织培养级别的成分。我们强烈建议购买尽可能多的培养基组成成分，因为这会最大程度上缩小不同批次的差异。总之，尽可能保证结果的一致性。神经球培养和分化的优化试剂可以从干细胞技术公司（Stem
Cell Technologies Inc.）购买（www．stemcell．com）。
2.4.1 商业化的培养基成分
磷酸盐缓冲液（D-PBS；Stem Cell Technologies，货号37350）
神经干细胞基础培养基（NeuroCultTM NSC basal media，货号05700）
10×激素混合物，神经干细胞增殖添加物（NeuroCultTM NSC proliferation
supplement，货号05701）
分化培养基（NeuroCultTM NSC Differentiation supplement，货号05703）
完全神经干细胞培养基（complete NSC
media）的制备在http：www．stemcell．comtechnicalmanuals．aspx网页有详细描述。
下面讲述实验室制备培养基组分。将450ml神经干细胞基础培养基和50ml神经干细胞增殖培养基混合在一起就是我们下面将要提到的添加激素的生长培养基［见2.4.3第（4）项］。在这种培养基中添加EGF和（或）bFGF就构成了完整的神经干细胞生长培养基。
2.4.2 培养基组分的配制
在实验室制备组织培养基和激素混合物，提前准备好组织培养用的玻璃容器。瓶子、量筒、烧杯等容器在高压灭菌之前，用蒸馏水冲洗几遍。在此强烈建议所有培养基和储存液只能在一次性的无菌管子和（或）瓶子中制备，以避免洗液残留或高压灭菌不当造成的污染。总之，尽可能使用商业化的储存液。
（1）30%葡萄糖（Sigma，货号G-7021）。将30g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中。过滤除菌，储存在4℃。
（2）7.5%碳酸氢钠（Sigma，货号S-5761）。将7.5gNaHCO3溶于100ml水中，过滤除菌，储存在4℃。
（3）1molLHEPES（Sigma，货号H-0887）。将238.3gHEPES溶于1L蒸馏水中，储存在4℃。
（4）3mmolL亚硫酸钠（Sigma，货号S-9133）。将1.93ml的蒸馏水加入到装有1mg亚硫酸钠的安瓿瓶中。混匀，分装到无菌管中，储存在-20℃。
（5）2mmolL孕酮（Sigma，货号P-6149）。将1.59ml95%的乙醇加入装有1mg孕酮的安瓿瓶中。混匀，分装到无菌管中，储存在-20℃。
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